Name: Étude des interactions bactéries-fongiques à l’aide de colonnes d’autoroutes fongiques dans divers environnements et substrats (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Découvrez l'enrichissement de paires bactéries-fongiques par colonnes d'autoroutes fongiques en microbiologie environnementale. Cette méthode permet d'étudier les interactions microbiennes dans divers substrats écologiques.

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<ol><li>Or, D., Smets, B. F., Wraith, J. M., Dechesne, A., Friedman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+constraints+affecting+bacterial+habitats+and+activity+in+unsaturated+porous+media+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Water+Resour%22%5BJournal%5D)">Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media - A review.</a> Adv Water Resour. 30 (6), 1505-1527 (2007).</li>
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<li>Guttridge, C., Shannon, A., O'Sullivan, A., O'Sullivan, K. J., O'Sullivan, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+3D+printing+resins+for+medical+applications%3A+A+review+of+marketed+intended+use%2C+biocompatibility+certification%2C+and+post-processing+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+3D+Print+Med%22%5BJournal%5D)">Biocompatible 3D printing resins for medical applications: A review of marketed intended use, biocompatibility certification, and post-processing guidance.</a> Ann 3D Print Med. 5, 100044(2022).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubes de 50 mL</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>5622-7261</td><td>Tubes de 50 mL pour la réalisation d’expériences en colonne en laboratoire</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri de 90 mm</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>08-757-099</td><td>Boîtes de Pétri pour la préparation de la gélose et pour la croissance microbienne</td></tr><tr><td>Imprimante 3D Asiga Freeform Pico Plus 39 pour traitement numérique de la lumière (DLP)</td><td>Asiga, Allemagne</td><td>Pico Plus 39 de forme libre</td><td>Imprimante 3D utilisée pour générer des lots de colonnes ; d’autres imprimantes 3D peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS40F20</td><td>Autoclave de paillasse pour stériliser les composants de la colonne</td></tr><tr><td>Gobelet</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100600</td><td>Bécher de 600 mL pour diverses utilisations tout au long du protocole</td></tr><tr><td>Résine Dentaire Claire LT V2</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-DLCL-02</td><td>Résine alternative pour l’impression 3D testée</td></tr><tr><td>Guide chirurgical dentaire résine</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-SGAM-01</td><td>A été utilisé pour générer les colonnes discutées dans le manuscrit ; D’autres résines photosensibles peuvent être utilisées à la place de ce matériau</td></tr><tr><td>Tubes de 1,5 mL à faible liaison d’ADN</td><td>Eppendorf</td><td>13-698-791</td><td>Tubes utilisés pour diverses préparations, y compris les extractions d’acides nucléiques</td></tr><tr><td>Conservateur de bouclier ADN/ARN</td><td>Recherche Zymo</td><td>Réf. R1100-50</td><td>Conservateur utilisé avant les extractions d’acides nucléiques</td></tr><tr><td>Bioinformatique EDGE</td><td>Libre; Développé par le Los Alamos National Laboratory (LANL)</td><td>n/a</td><td>Plate-forme bioinformatique pour le traitement des données d’amplicons</td></tr><tr><td>Kit de spin FastDNA pour le sol</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>Référence 116560200-CF</td><td>Option de kit d’extraction d’ADN pour le sol</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-300</td><td>Pinces stérilisables</td></tr><tr><td>Résine transparente Formlabs BioMed</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-BMCL-01</td><td>Résine alternative pour l’impression 3D testée</td></tr><tr><td>Imprimante 3D stéréolithographique (SLA) Form 3B+ de Formlabs</td><td>Formlabs</td><td>Formulaire 3B+</td><td>Imprimante 3D alternative</td></tr><tr><td>Résine IBT de Formlabs</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-IBCL-01</td><td>Résine alternative pour l’impression 3D testée</td></tr><tr><td>Boucles d’inoculation</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-598</td><td>Utilisé pour isoler/transférer des microbes</td></tr><tr><td>Gélose à l’extrait de malt (MEA)</td><td>Critère</td><td>89405-654</td><td>Type de média utilisé dans les colonnes</td></tr><tr><td>Séquenceur MiSeq + kit de séquençage MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>Peut utiliser d’autres séquenceurs</td></tr><tr><td>Mortier & Pilon</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB961K ; FB961A</td><td>Peut utiliser n’importe quel mortier et pilon qui peut être stérilisé entre les utilisations</td></tr><tr><td>Kit de préparation de bibliothèque d’ADN NEBNext Ultra II pour Illumina</td><td>Biolabs de la Nouvelle-Angleterre</td><td>E7805S</td><td>Kit de préparation de banque pour le séquençage métagénomique</td></tr><tr><td>Kit de préparation de la banque d’ADN Nextera XT (24 échantillons)</td><td>Illumina</td><td>Référence FC-131-1024</td><td>Kit de préparation de bibliothèque pour le séquençage d’amplicon</td></tr><tr><td>BORD NMDC</td><td>Open source : Développé par le National Microbiome Data Collaborative (NMDC)</td><td>n/a</td><td>Plateforme bioinformatique pour le traitement des données métagénomiques</td></tr><tr><td>Maille en nylon</td><td>Séfar</td><td>03-25/19</td><td>Le treillis utilisé dans le cadre de la construction de la colonne</td></tr><tr><td>Pointes de pipette</td><td>Rainin</td><td>30807966</td><td>Peut utiliser de nombreux embouts de pipette stérilisés différents pour les étapes du protocole</td></tr><tr><td>Gélose à la pomme de terre au dextrose</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-14200-28</td><td>Type de média utilisé dans les colonnes</td></tr><tr><td>QIIME2</td><td>Libre</td><td>n/a</td><td>Logiciel de traitement des données d’amplicon</td></tr><tr><td>Kit de dosage HS Qubit dsDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Question n°32851</td><td>Utilisé pour quantifier l’ADN après extractions</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Question n°33238</td><td>Utilisé pour quantifier l’ADN après extractions</td></tr><tr><td>Kit de mini-préparation fongique / bactérien à ADN rapide</td><td>Recherche Zymo</td><td>D6005</td><td>Option de kit d’extraction d’ADN qui fonctionne à la fois avec les bactéries et les champignons</td></tr><tr><td>Gélose R2A</td><td>BD Difco</td><td>218263</td><td>Un type de média utilisé dans les colonnes (milieux bactériens)</td></tr><tr><td>Rack pour tubes de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-11</td><td>Support pour maintenir des tubes de 50 ml à la verticale</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-155</td><td>Ciseaux fins de précision qui peuvent être stérilisés</td></tr><tr><td>Milieu de carboxyméthylcellulose sodique</td><td>Aldrich</td><td>Réf. 419273-100G</td><td>Type de média utilisé dans les colonnes</td></tr><tr><td>Logiciel de CAO SolidWorks</td><td>SolidWorks (en anglais)</td><td>n/a</td><td>Logiciel utilisé pour concevoir les colonnes</td></tr><tr><td>Pelle à truelle</td><td>Fisher Scientific</td><td>Réf. S41701</td><td>Pour faire une dépression dans le substrat avant d’ajouter la colonne</td></tr><tr><td>Eau distillée sans DNase/RNase ultra-pure</td><td>Invitrogen : ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td>Eau pour le bain-marie à ultrasons</td></tr><tr><td>Ultrasoniseur</td><td>Fisher Scientific</td><td>Réf. FB-11201</td><td>Ultrasoniseur pour le nettoyage des colonnes</td></tr></tbody></table>

Étude des interactions bactéries-fongiques à l’aide de colonnes d’autoroutes fongiques dans divers environnements et substrats

Investigating Bacterial-Fungal Interactions using Fungal Highway Columns in Diverse Environments and Substrates

La colonne d’autoroute fongique entièrement assemblée mesure environ 5 cm de longueur (figure 1). La colonne ne doit être cassée dans aucun endroit, et les capuchons et l’anneau fileté doivent s’emboîter facilement et étroitement pour créer des microenvironnements à l’intérieur de la colonne. La maille du filtre peut s’étendre au-delà de l’anneau fileté (comme illustré à la figure 1 et à la figure 2), ou elle peut être coupée avec des ciseaux stérilisés. Les bouchons de gélose doivent être bien ajustés à chaque extrémité de la colonne. Lorsqu’elle est placée dans le substrat, la maille filtrante doit entrer en contact avec le substrat et la colonne ne doit pas être complètement enterrée.
Les colonnes ont déjà été testées dans du fumierde cheval 9. Les colonnes ont également été placées dans du sol en vrac et de la rhizosphère sur un terrain de recherche, ainsi que dans de petits volumes de sol dans des tubes de 50 mL en laboratoire (figure 3). Une fois que les colonnes fongiques de la route ont été retirées du substrat et démontées, la croissance microbienne était visible sur l’appât et les bouchons du milieu cible (exemples illustrés à la figure 4A). Les bactéries et les champignons ont été isolés des milieux cibles et des amorces à l’aide de techniques de sous-culture (figure 4B), et les microbes présents sur les bouchons de milieu ont été identifiés taxonomiquement à l’aide du séquençage d’amplicons (figures 4C et D). Les figures 4C et D représentent les résultats combinés du séquençage des amplicons dans plusieurs expériences, montrant quels microbes ont pu atteindre le bouchon du milieu cible à partir de colonnes ajoutées à la bouse de cheval9. Des visualisations de ces données bactériennes et fongiques ont été générées comme indiqué à l’étape 17. Les résultats peuvent également être présentés sous forme d’abondances relatives de taxons.
Des résultats sous-optimaux ont été obtenus dans des cas où les colonnes ont été ajoutées à des environnements extrêmement peu humides, et les bouchons de média ont été complètement desséchés en quelques jours, ce qui n’a entraîné aucune récupération des microbes colonisés (Figure 5A). Nous avons également vu des cas où les microbes ne se développent tout simplement pas à partir du bouchon du milieu cible (figure 5B), et des cas où nous ne récupérons pas suffisamment de données de séquençage du bouchon du milieu cible pour des analyses significatives. D’autres cas où des champignons prolifèrent hors des colonnes ont également entraîné la nécessité de refaire les expériences (Figure 5C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66989/66989fig03.jpg"> 
Figure 3 : Exemples de colonnes placées dans des échantillons environnementaux en laboratoire et sur le terrain. (A) Colonne placée à l’intérieur d’un tube de 50 mL avec un sol humidifié en laboratoire. Également illustré avec une règle pour l’échelle. (B) Colonne placée dans le sol dans le champ. (C) Colonne placée dans le réseau racinaire d’une plante dans le champ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66989/66989fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66989/66989fig04.jpg"> 
Figure 4 : Résultats représentatifs d’expériences réussies sur colonnes. (A) Exemples de bouchons de médias colonisés extraits de colonnes. (B) Exemples d’isolats fongiques sous-cultivés à partir de milieux cibles. Le substrat était de la terre. Séquence ITS du haut Identité NCBI BLAST de gauche à droite : Rhizopus azygosporous, Aspergillus novofumigatus, Curvularia subpapendorfii et Phaeomycocentrospora cantuariensis. (C,D) Cladogrammes circulaires montrant la diversité phylogénétique de (C) séquences fongiques ITS et (D) bactériennes 16S récupérées dans le milieu cible à la suite de multiples expériences sur des autoroutes fongiques utilisant de la bouse de cheval. Les sections sont colorées et étiquetées par embranchement, les nœuds finaux représentant des genres uniques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66989/66989fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66989/66989fig05.jpg"> 
Graphique 5. Résultats sous-optimaux des expériences en colonne. (A) Un exemple de bouchon de média desséché résultant de conditions environnementales de faible humidité. (B) Exemple d’absence de croissance microbienne à partir d’un bouchon de support de colonne. (C) Exemple de prolifération du champignon par le haut (milieu cible) de la colonne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66989/66989fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Bacterial-fungal interactions (BFIs) play an integral role in shaping microbial community composition, biogeochemical functions, spatial dynamics, and ...

[Narrateur] Cette étude se concentre sur les interactions fongiques bactériennes pour comprendre comment ces microbes peuvent influencer les comportements des autres. Ce travail étudie les bactéries qui utilisent l’hyphy fongique pour le transport. Mieux comprendre ces interactions permet d’étudier des microbiomes complexes dans des environnements tels que le sol. Les examens du transport bactérien le long des hyphes ont traditionnellement été effectués sur des boîtes de Pétri modifiées, mais les progrès récents de la technologie d’impression 3D ont permis de concevoir et de fabriquer des dispositifs capables de mieux imiter les conditions natives d’interaction de ces microbes. Ces colonnes d’autoroutes fongiques ont été utilisées avec succès dans le sol, les rhisosphères et les herbivores dans des environnements sur deux continents. Ces dispositifs peuvent également servir d’outils pédagogiques efficaces ou être appliqués par d’autres groupes de recherche pour élargir les connaissances collectives sur les interactions fongiques bactériennes. Pour commencer, versez le milieu à base de vis sans fin stérilisé dans des boîtes de Pétri de 90 millimètres jusqu’à ce que la vis sans fin soit proche du haut des côtés des boîtes de Pétri. Ensuite, placez une extrémité d’une colonne d’autoroute fongique sur l’une des plaques de média solidifiées. Soulevez la colonne du support dans un mouvement tordu de sorte que la tarière reste à l’intérieur de l’extrémité de la colonne et crée un bouchon de média. Ajoutez le petit capuchon sur l’extrémité avec le bouchon du milieu pour maintenir un microenvironnement stérile pour le milieu cible. Retournez la colonne et créez une prise multimédia pour l’autre extrémité. À l’aide de ciseaux stérilisés, coupez un morceau circulaire d’un treillis en nylon autoclave d’un diamètre de deux centimètres. Posez le treillis sur l’extrémité exposée de la colonne. Torsadez l’anneau fileté sur l’extrémité de l’appât de la colonne tout en fixant le treillis à l’intérieur des fils. Maintenant, placez un grand capuchon au bas de la colonne sur le treillis et l’autre extrémité de l’anneau fileté. Mettre en place un microcosme des sols en laboratoire. Retirez le grand capuchon du bas de la colonne pour exposer l’anneau fileté et le treillis. Ajoutez la colonne au microcosme du sol de manière à ce que toute la partie inférieure soit dans le sol. Retirez la colonne après qu’elle ait été en contact avec le substrat pendant la durée souhaitée. Secouez soigneusement tout excès de substrat et replacez le grand capuchon au bas de la colonne sous le treillis. Placez la colonne dans un tube de 50 millilitres pour le transport. Transférez la colonne dans un environnement stérile tel qu’une enceinte de sécurité biologique. Retirez le grand capuchon du support d’appât, l’anneau fileté et le grillage. Retirez ensuite le petit capuchon de l’extrémité de la colonne contenant le fluide cible. Utilisez des pinces stérilisées pour extraire le bouchon. Transférez la fiche du média cible directement au centre d’une boîte de Pétri de 90 millimètres contenant un milieu de tarière. Pour extraire l’ADN, congelez d’abord l’ensemble des bouchons de la vis sans fin ou les morceaux sélectionnés des colonnes dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre à moins 20 degrés Celsius. Vous pouvez également immerger les morceaux de la motte dans un produit de préservation contenu dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre avant l’extraction. Découpez un morceau de tarière d’un centimètre contenant une croissance microbienne à partir de la cible cultivée ou du milieu d’appât. Pour l’extraction de colonies bactériennes isolées, utilisez une boucle d’inoculation stérile pour glisser une colonie de la plaque. Faites tourner la boucle directement dans le tampon d’extraction d’ADN disponible dans le commerce. Pour l’extraction de champignons isolés, utilisez un mortier et un pilon pour broyer les morceaux de la tarière séparément dans de l’azote liquide. Transférez les échantillons broyés dans des tubes d’extraction. À l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commercial optimisé pour les bactéries et les champignons, extrayez l’ADN. Utilisez ensuite un fluorimètre pour quantifier l’ADN résultant. La croissance microbienne était visible sur l’appât et sur les bouchons du milieu cible après que les colonnes fongiques de la route ont été retirées du substrat et démontées. Les bactéries et les champignons ont été isolés du milieu cible et de l’amorce par des techniques de sous-culture. Les microbes présents sur les prises de média ont été identifiés taxonomiquement. Aucune récupération des microbes colonisés n’a été constatée lorsque les colonnes ont été ajoutées à des environnements à très faible humidité. Dans certains cas, les microbes ne se sont tout simplement pas développés à partir du bouchon du milieu cible ou une prolifération de champignons a été observée à travers le haut de la colonne.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source : Schlafer, S, et Frost Kristensen, M. Surveillance du pH extracellulaire dans des biofilms inter-royaumes à l’aide de la microscopie confocale. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre la culture de biofilms inter-règnes de Streptococcus mutans et Candida albicans dans des conditions de type oral pour modéliser les interactions bactériennes-fongiques, permettant d’étudier la synergie microbienne, l’adhésion médiée par le glucan et la virulence acidogénique dans la pathogenèse orale.

Établissement de biofilms bactérien-fongiques inter-règnes pour l’étude de la pathogenèse orale

Source : Miquel Guennoc, C., et al. Nouvelle méthode d’analyse qualitative multi-échelle des biofilms bactériens sur des colonies fongiques filamenteuses utilisant la microscopie confocale et électronique. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre la préparation d’une culture fongique sur des membranes de cellophane traitées pour soutenir la formation de colonies et la croissance radiale. Il montre ensuite la culture et la préparation des cellules bactériennes du sol pour des tests d’interaction.

Établissement d’une coculture fongique-bactérienne pour la formation de biofilms

Cette vidéo décrit une méthode de culture et d’analyse qualitative des biofilms bactériens sur les hyphes fongiques à l’aide de la microscopie. Les biofilms bactériens se forment fréquemment sur les surfaces fongiques et impliquent de nombreux processus d’interaction bactério-fongique, tels que la coopération métabolique, la compétition ou la prédation.

Procédé de préparation d’échantillons pour visualiser des bactéries formant un biofilm sur des hyphes fongiques

Les bactéries produisent des composés sécrétés qui ont le potentiel d'affecter la physiologie de leurs voisins microbiennes. Nous décrivons ici un écran de co-culture qui permet la détection de ces médiation chimiquement interspécifiques interactions en mélangeant les microbes du sol avec des souches rapporteurs fluorescents transcription de Bacillus subtilis sur milieu solide.

Utilisation de co-culture pour détecter les interactions interspécifiques par voie chimique

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour développer et analyser qualitativement les biofilms bactériens sur les hyphes fongiques par microscopie confocale et électronique.

Une nouvelle méthode d&#39;analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique

La plupart des usines au sein des communautés susceptibles sont reliés entre eux par des champignons mycorhiziens à arbuscules (AM), mais la médiation des interactions entre les plantes par eux a été étudiée principalement par la culture de plantes avec ou sans mycorhizes. Nous présentons une méthode pour manipuler des réseaux mycorrhizal communs chez les plantes mycorhizées pour enquêter sur les conséquences des interactions entre les plantes.

Étude des interactions entre les plantes à travers des réseaux Mycorrhizal communs en utilisant des noyaux pivotés

Les tests d'interaction de co-culture présentés dans ce protocole sont peu coûteux, haut débit, et simple. Ces essais peuvent être utilisés pour observer les interactions microbiennes dans la co-culture, identifier les modèles d'interaction et caractériser le potentiel inhibiteur d'une souche microbienne d'intérêt contre les agents pathogènes humains et environnementaux.

Tests de co-culture à haut débit pour l'étude des interactions microbiennes

Nous présentons ici un protocole de criblage de la biodiversité des sols afin de rechercher les souches fongiques impliquées dans la dégradation des matériaux récalcitrants. Tout d’abord, les souches fongiques capables de se développer sur les acides humiques ou la lignocellulose sont isolées. Leur activité est ensuite testée à la fois dans des essais enzymatiques et sur des polluants tels que les hydrocarbures et les plastiques.

Isolement et dépistage de la biodiversité du sol à la recherche de champignons impliqués dans la dégradation des matériaux récalcitrants

Ce protocole vise à fournir des procédures détaillées pour la collecte, la fixation et la conservation d’échantillons de plantes mycohétérotrophes, en appliquant différentes techniques de microscopie telles que la microscopie électronique à balayage et à transmission, la microscopie optique, confocale et à fluorescence pour étudier la colonisation fongique dans les tissus et les graines des plantes germées avec des champignons mycorhiziens.

Techniques de microscopie pour interpréter la colonisation fongique dans les tissus végétaux mycohétérotrophes et germination symbiotique des graines

En raison de l’opacité du sol, les interactions entre ses microbes constitutifs ne peuvent pas être facilement visualisées avec une résolution cellulaire. Ici, deux outils microfluidiques sont présentés, qui offrent de nouvelles opportunités pour étudier les interactions fongiques-microbiennes. Les appareils sont polyvalents et simples à utiliser, permettant un contrôle spatio-temporel élevé et une imagerie haute résolution au niveau cellulaire.

Outils microfluidiques pour sonder les interactions fongiques-microbiennes au niveau cellulaire

Découvrez l'enrichissement de paires bactéries-fongiques par colonnes d'autoroutes fongiques en microbiologie environnementale. Cette méthode permet d'étudier les interactions microbiennes dans divers substrats écologiques.

Étude des interactions bactéries-fongiques à l’aide de colonnes d’autoroutes fongiques dans divers environnements et substrats

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