Name: Immunocoloration intégrale et comptage automatique des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Découvrez l'immunocoloration intégrale de la rétine de souris et le comptage automatisé des cellules ganglionnaires rétiniennes par IA. Cette méthode accélère l'évaluation des traitements contre le glaucome.

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<meta charset="utf8"></head><body>Immunomarquage et comptage des CGR basé sur l’IA dans la rétine entière de souris

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
<li>Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial-ethnic+disparities+in+concurrent+rates+of+peripapillary+%26+macular+OCT+parameters+among+a+large+glaucomatous+clinical+population%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population.</a> Eye. , (2024).</li>
<li>Atkinson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+measure+of+patient+satisfaction+with+ocular+hypotensive+medications%3A+the+Treatment+Satisfaction+Survey+for+Intraocular+Pressure+%28TSS-IOP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Qual+Life+Outcomes%22%5BJournal%5D)">A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP).</a> Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mouse-fixation+device+for+IOP+measurement+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice.</a> Vision Res. 219, 108397(2024).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+counting+of+retinal+ganglion+cells+in+the+entire+mouse+retina+based+on+improved+YOLOv5%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Res%22%5BJournal%5D)">Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5.</a> Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).</li>
<li>Al-Khindi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Tbx5+regulates+direction-selective+retinal+ganglion+cell+development+and+image+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization.</a> Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).</li>
<li>Claes, M., Moons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells%3A+Global+number%2C+density+and+vulnerability+to+glaucomatous+injury+in+common+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice.</a> Cells. 11 (17), 2689(2022).</li>
<li>Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-based+whole-mount+preparation+for+the+investigation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (194), e65222(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1& fois ; PBS</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa594-conjugué chèvre anti-lapin IgG&nbsp ; (H+L)</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-BRN3A [EPR23257-285]</td><td>Abcam</td><td>ab245230</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel</td><td></td><td></td> AutoCount <td>https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs</td></tr><tr><td>Disque Cloud</td><td>Lien</td><td></td> du lecteur Google <td>https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6&nbsp ;</td></tr><tr><td>Disque cloud</td><td>Baidu link</td><td>Code d’extraction : g44k</td><td>https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg&nbsp ;</td></tr><tr><td>Marqueur</td><td>Sharpie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Biosharp, Labgic</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Macklin</td><td>P804536</td><td></td></tr><tr><td>ProClean 300</td><td>Beyotime</td><td>ST853</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>BBI, Sangon</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioFroxx, neoFroxx</td><td>1139ML100</td><td></td></tr></tbody></table>

immunocoloration intégrale et comptage automatique des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells

Ce protocole détaille la méthodologie d’immunomarquage complet des rétines de souris, garantissant une préparation méticuleuse des tissus, une incubation précise des anticorps et un comptage cellulaire automatisé fiable. La procédure facilite le marquage et la quantification robustes des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR), permettant une évaluation précise des populations cellulaires dans divers contextes expérimentaux. La méthode a été utilisée pour compter les CGR chez des souris de type sauvage et modélisées par le glaucome, ce qui a donné des résultats cohérents. Un résultat représentatif montre que le nombre de CGR chez une souris adulte normale à l’âge de 2 mois est d’environ 45 000 (Figure 6).
Pour évaluer si le logiciel d’IA peut quantifier avec précision les CGR marqués à BRN3a dans des modèles normaux et pathologiques, nous avons généré un modèle murin de glaucome7 induit par N-méthyl-D-aspartate (NMDA). La rétine entière de ce modèle a été immunomarquée avec de l’anti-BRN3A, et les RGC ont été quantifiés à l’aide du logiciel de comptage automatique. Le résultat a indiqué une coloration de fond relativement élevée (figure 7). Néanmoins, le logiciel a été en mesure d’identifier avec précision presque tous les RGC. Au total, 15 231 CGR ont été identifiés dans cette rétine, contre environ 45 000 à 50 000 CGR dans une rétine de souris normale, indiquant une dégénérescence sévère. Ainsi, le logiciel d’IA peut également être utilisé efficacement pour compter les CGR dans les rétines dont la qualité de coloration est moins optimale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma de principe pour la préparation du RGC. (A) Le globe oculaire est retiré et placé dans 1x PBS. (B) Le globe oculaire est fixé dans 4% de PFA sur de la glace pendant 3 h. (C) Enlèvement de la cornée. (D) Extraction de la lentille. (E) L’œilleton est divisé en 4 rabats à l’aide de ciseaux. (F) La sclérotique est décollée et les débris sont délicatement retirés de la surface de la rétine à l’aide d’une brosse douce. (G) La rétine est immunomarquée avec des anti-BRN3A. (H) Les signaux fluorescents sont imagés à l’aide d’un microscope confocal. (I) Comptage automatique des RGC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig02v3.jpg"> Figure 2 : Isolement de la rétine de la souris dans son intégralité. (A) La souris est euthanasiée par luxation cervicale. (B) La souris est placée sur une surface plane. (C) Le globe oculaire est soigneusement retiré avec des ciseaux. (D) Le globe oculaire est doucement placé dans 1x PBS. (E) Le globe oculaire est fixé à l’aide d’une pince au bord de la cornée. (F) Une petite incision est pratiquée sur le bord de la cornée à l’aide d’une aiguille. (G) La structure en forme de bol est retirée après avoir retiré la cornée. (H) La lentille est soigneusement retirée à l’aide d’une pince. (I) Une petite incision est pratiquée le long du bord de la cornée vers le nerf optique sur la sclérotique, évitant ainsi d’endommager la rétine. (J) La sclérotique est déchirée le long de l’incision à l’aide d’une pince. (K) La rétine est aplatie et nettoyée avec un pinceau. (L) La rétine est aplatie et rapidement fixée avec du méthanol glacé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig03.jpg"> Figure 3 : Immunocoloration de la rétine de souris dans son ensemble. (A) Après le lavage avec 1x PBS, la rétine est bloquée par un tampon de blocage. (B) La rétine est incubée avec un anticorps primaire à 4 °C pendant la nuit. (C) La rétine est lavée trois fois avec 1x PBS. (D) La rétine est incubée avec un anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante. (E) La rétine est montée sur une lame de verre avec les CGR vers le haut. (F) Les images sont acquises à l’aide d’un microscope confocal laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig04.jpg"> Figure 4 : Installation d’un logiciel de comptage automatique. (A) L’étape 1 consiste à mettre à jour le chemin d’accès au fichier dans le répertoire « yolov5_cpu ». (B) L’interface graphique est lancée. (C) Vérification de la présence du fichier modèle dans le répertoire racine du lecteur C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig05.jpg"> Figure 5 : Fonctionnement du logiciel de comptage automatisé RGC. (A) Le logiciel de comptage est ouvert. (B) Vous cliquez sur le bouton OUVRIR L’IMAGE pour importer l’image. (C) Vous cliquez sur le bouton RUN pour lancer le comptage automatique. (D) Les cellules comptées sont marquées d’une case carrée rouge et le numéro de cellule est affiché dans le coin supérieur droit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig06.jpg"> Figure 6 : Comptage automatisé des RGC de souris. Le panneau supérieur (à gauche) montre des résultats représentatifs de l’immunocoloration de la rétine à montage plat avec l’anti-BRN3A ; le panneau supérieur (à droite) montre le comptage automatisé des CGR à l’aide d’un logiciel précédemment développé. Barre d’échelle : 100 μm. Les inserts des panneaux supérieurs sont agrandis et affichés dans le panneau inférieur, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig07.jpg"> Figure 7 : Comptage des RGC dans un modèle murin de glaucome induit par NMDA. Panneau de gauche : Vue d’ensemble de la rétine de la monture entière, montrant les RGC reconnus par le logiciel d’IA. Panneau de droite : Vue agrandie d’une partie de la rétine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Immunocoloration intégrale et comptage automatique des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris

Glaucoma is a leading cause of blindness globally, characterized by a complex pathogenic mechanism that makes vision restoration challenging. Mice serve ...

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