Ingénierie des protéines par affichage de surface de levure

Dans mon laboratoire, nous concevons des thérapies cellulaires de nouvelle génération en combinant l’ingénierie des protéines et l’ingénierie cellulaire. Nous concevons donc des composants protéiques pour obtenir de nouvelles fonctions ou pour améliorer celles existantes, puis nous incorporons ces protéines nulles dans des thérapies cellulaires. Nous avons perfectionné l’utilisation de l’affichage de surface pour des applications spécialisées, notamment l’ingénierie de la stabilité des protéines, l’ingénierie des commutateurs de protéines régulés à petites molécules et le ciblage spécifique des confirmations de récepteurs activés associés au cancer.

L’avantage de l’affichage de la surface de la levure par rapport à d’autres technologies d’affichage telles que l’affichage des phages ou des ribosomes, est la visualisation cytométrique en flux de la bibliothèque pendant le processus de tri et le contrôle précis des conditions de sélection, telles que la concentration d’antigène et la rigueur de la porte de tri. Pour commencer, préparez les billes pour la première sélection de billes en remettant en suspension 10 microlitres de billes magnétiques de liant de biotine dans 990 microlitres de PBSA. Pour le lavage, placez le tube sur une grille magnétique pendant deux minutes avec le couvercle ouvert.

Retirez ensuite avec précaution le surnageant. Remettre en suspension les billes lavées dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre dans un millilitre de PBSA avec 6,7 à 33 picomoles d’antigène biotinylé. Après l’incubation, placez le tube sur une grille magnétique pendant deux minutes avec le couvercle ouvert, retirez le surnageant et lavez les billes chargées d’antigène avec un millilitre de PBSA.

Une fois que les billes se sont déposées, retirez le PBSA. Ensuite, mettez en suspension les billes chargées d’antigène dans 50 microlitres de PBSA. Préparez les cellules, les billes d’antigène et une solution de perles d’ours pour les sélections négatives.

Après le lavage, remettre en suspension les billes d’antigène dans 50 microlitres de PBSA et remettre en suspension les billes d’ours dans 150 microlitres de PBSA. Pour la première sélection négative, ajoutez 50 microlitres de billes nues lavées à 950 microlitres de cellules lavées dans du PBSA et incubez le mélange pendant 1,5 heure à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, placez les tubes contenant les suspensions de cellules de billes d’ours sur un support magnétique avec le couvercle ouvert.

Pipetez tout liquide contenu dans le couvercle dans le tube et attendez deux minutes. Transférez ensuite les cellules non liées dans un micro tube à centrifuger frais et ajoutez 50 microlitres de perles d’ours lavées. Après trois cycles de sélection négative, ajoutez 50 microlitres de solution de billes chargées d’antigène dans les cellules.

Incuber pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Placez maintenant les cellules contenant les billes chargées d’antigène sur un support magnétique avec le couvercle ouvert. Pipetez tout liquide qui se trouve dans le couvercle dans le tube.

Attendez deux minutes avant de jeter les cellules non liées. Effectuez toutes les étapes restantes comme décrit pour la sélection de la première bille d’antigène. Après trois sélections négatives et une sélection positive, remettre rapidement les cellules en suspension dans un millilitre de SDCAA et les transférer dans un flacon agitateur contenant un plus grand volume de SDCAA.

Après l’induction pendant la nuit de l’expression de surface des protéines dans SGCAA dans les banques de levures, granulez suffisamment de cellules pour couvrir 10 fois la diversité et éliminez le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans du PBSA et transférez-la dans des microtubes à centrifuger. Utilisez 30 millions de cellules pour la coloration dans chaque tube.

Préparez autant de tubes que nécessaire en fonction de la diversité, y compris un tube témoin sans l’antigène. Ensuite, centrifugez les tubes à 2000 x g pendant cinq minutes à température ambiante. Remettre la pastille en suspension dans 200 microlitres de PBSA contenant l’antigène et incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Après avoir effectué à nouveau la centrifugation, retirez le PBSA de la pastille. Ensuite, réinstallez les cellules en suspension dans 100 microlitres de PBSA froid contenant des anticorps pour la coloration d’affichage et la détection de l’antigène. Incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Après l’incubation, centrifugez les cellules à 2000 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ajoutez un millilitre de PBSA à la pastille et répétez la centrifugation. Retirez ensuite la majeure partie du surnageant, en ne laissant que 20 à 30 microlitres pour éviter que la pastille ne se dessèche.

Remettez le granulé en suspension dans du PBSA froid juste avant le tri. Maintenant, triez les cellules directement dans un milieu SDCAA. Après le tri, transférez les cellules dans un flacon agitateur contenant un plus grand volume de milieu SDCAA et incubez à 30 degrés Celsius avec agitation à 180 tr/min.