Isolement, caractérisation et analyse protéomique de vésicules extracellulaires dérivées du plasma pour la découverte de biomarqueurs cardiovasculaires

Les vésicules extracellulaires circulantes en tant que biomarqueurs sont un domaine relativement nouveau dans la recherche sur les biomarqueurs avec un immense potentiel. Notre protocole vise à fournir une approche pratique pour mettre en œuvre la découverte et la détection de biomarqueurs liés aux vésicules extracellulaires dans un service d’urgence. De nouvelles preuves ont montré que la cargaison moléculaire présente dans les vésicules extracellulaires et la circulation contient des protéines et de l’ARN d’intérêt dans de multiples contextes pathologiques.

Plusieurs nouvelles vésicules extracellulaires, biomarqueurs enfermés, ont été associées au diagnostic et au pronostic de diverses entités de maladies cardiovasculaires. Les principaux défis dans le domaine de la découverte de biomarqueurs de vésicules extracellulaires circulantes sont la préservation des vésicules extracellulaires et l’acquisition de plasma dépendant de la dynamique de libération des VE. Par conséquent, un protocole rigoureux intégré dans la routine clinique est nécessaire pour éviter la dégradation de l’EV et maintenir des résultats reproductibles, en particulier lors de l’application de méthodes d’analyse à grande échelle telles que la protéomique.

La découverte de biomarqueurs protéiques enfermés dans les VE circulants dépend fortement du moment de la prise de sang initiale par rapport à l’apparition des symptômes, et de la durée de stockage des échantillons due à la dégradation naturelle des VE. Ce protocole offre un protocole pratique d’isolement et d’introduction des VE plasmatiques dans l’analyse protéomique à intégrer dans le flux de travail clinique d’un service d’urgence. Nos recherches à venir porteront sur l’intégration de différents collectifs de patients dans notre méthodologie, parmi lesquels figurent des patients atteints d’insuffisance cardiaque décompensée, d’arythmies ou de cardiomyopathie tachycardie, ainsi que des études longitudinales de patients subissant un pontage.

À l’aide de ce protocole, nous visons à identifier de nouveaux biomarqueurs liés aux VE contribuant au diagnostic et au pronostic des pathologies susmentionnées. Pour commencer, centrifuger le plasma sanguin humain, à l’aide d’une ultra-centrifugeuse avec un rotor à angle fixe sans se casser. Une fois que les débris et le corps apoptotique se sont déposés, transférez le surnageant dans un nouveau tube et une ultra-centrifugeuse à 100 000 G pendant deux heures à quatre degrés Celsius sans casser pour isoler les vésicules extracellulaires.

Retirez le tube avec précaution après l’ultracentrifugation. À l’aide d’une pipette électronique, aspirez doucement le surnageant, laissant environ un millilitre de plasma appauvri en vésicules extracellulaires. Passez à une pipette de 1000 microlitres pour pipeter soigneusement le plasma restant sans perturber la pastille de la vésicule extracellulaire.

Inclinez progressivement le tube pendant le pipetage pour éviter qu’il ne reste de plasma et remettez la pastille en suspension dans du PBS. Ensuite, diluez la solution mère de vésicules extracellulaires avec du PBS glacé à différents ratios pour obtenir une plage de comptage final de 10 à 100 nanoparticules par image pendant le suivi. Allumez l’instrument NTA et lancez le logiciel applicable sur l’ordinateur connecté.

Insérez la chambre dans le cercueil laser et cliquez sur démarrer la caméra pour l’activer. Prélevez un millilitre de PBS dans une seringue et connectez-la au tube avant. Rincez soigneusement le système de tuyauterie, en vous assurant qu’aucune bulle d’air ne reste dans la chambre.

Surveillez la caméra pour détecter les bulles d’air ou les particules contaminantes. Maintenant, aspirez la dilution de travail de la vésicule extracellulaire préparée dans une seringue d’un millilitre et injectez-la dans la chambre. Accédez aux onglets Capture et Traitement pour ajuster le gain de l’écran en fonction de la luminosité du moniteur.

Modifiez le niveau de la caméra pour améliorer la différenciation des nanoparticules à l’écran. Définissez un seuil de détection approprié dans l’onglet Processus pour différencier les particules du bruit de fond. Faites la mise au point de l’appareil photo à l’aide de la molette de mise au point de chaque côté de l’instrument jusqu’à ce que les nanoparticules apparaissent nettes à l’écran.

Après avoir réglé une température constante de 22 degrés Celsius pour toutes les mesures dans les paramètres matériels, cliquez sur le bouton d’exécution pour lancer la mesure. Enregistrez au moins trois vidéos de 30 secondes chacune pour chaque échantillon. Cliquez sur modifier pour saisir le facteur de dilution des échantillons, et enfin cliquez sur exporter pour enregistrer les résultats.

À l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules, les vésicules extracellulaires ont été identifiées et visualisées en fonction du brownie et du mouvement. L’analyse a révélé une concentration moyenne de particules de 1,2 fois 10 à la puissance 10 particules par millilitre dans le plasma d’individus sains démontrant la présence de vésicules extracellulaires. La taille moyenne des vésicules extracellulaires plasmatiques a été mesurée à 184,7 nanomètres, ce qui correspond aux dimensions typiques des vésicules extracellulaires.