Name: Évaluation de l’activité de la DNase par transfert d’énergie de résonance de fluorescence ratiométrique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Découvrez une méthode FRET ratiométrique pour évaluer l'activité de la DNase avec une sensibilité élevée. Cette approche permet d'analyser l'influence du pH et de la température sur l'activité enzymatique en temps réel.

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L’approche de fluorescence ratiométrique est une méthode analytique qui utilise des rapports de signaux de fluorescence au lieu de se fier uniquement à l’intensité d’un seul signal 1,2. L’avantage d’utiliser les rapports est qu’ils permettent un étalonnage interne et compensent de nombreux facteurs aléatoires, tels que les variations de concentrations d’échantillons et de sondes, les paramètres de l’instrument, etc. Cela améliore la précision et la sensibilité des sondes fluorescentes.
Dans le contexte spécifique des sondes de transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET), le terme « ratiométrique » fait référence au fait que la mesure est basée sur le rapport de deux signaux d’émission de la paire de fluorophores donneurs et accepteurs FRET. Pour quantifier l’activité de l’analyte cible, les sondes FRET ratiométriques utilisent le rapport des intensités d’émission accepteur/donneur (ou, dans certains cas, le rapport donneur/accepteur inversé). Le rapport est directement lié à l’efficacité du FRET. Il fournit un mécanisme d’auto-normalisation qui minimise le bruit de fond et tient compte des variations des conditions d’éclairage et de la concentration de la sonde3.
Parmi les applications intéressantes récentes de la méthode ratiométrique, citons son utilisation dans les biocapteurs électrochimiques ratiométriques pour la détection de l’ADN tumoral circulant (ADNct)4,5, dans les bio-nanomachines browniennes alimentées par le mouvement pour la détection FRET de la phase phagocytaire de l’apoptose6, et pour le marquage FRET express et l’analyse de la clairance phagocytaire7. L’approche FRET ratiométrique décrite dans ce travail est utile pour l’évaluation quantitative de l’activité de la DNase. Les mesures de dosage sont basées sur les rapports des émissions de la paire FRET. En raison de sa capacité à détecter même un clivage mineur et lent de l’ADN, le test est particulièrement bien adapté à l’étude de l’activité nucléolytique faible nécessitant des périodes d’observation plus longues et aux expériences à différents niveaux de pH.
Ici, certains avantages spécifiques du test FRET ratiométrique sont illustrés par son application à l’étude de l’activité DNase d’un inhibiteur faible de l’élastase nucléasique-leucocytaire (LEI). Le rapport comprend un protocole détaillé avec des instructions étape par étape et une description de l’analyse des données ratiométriques.
Description de la sonde FRET ratiométrique
La sonde FRET ratiométrique est un oligo d’ADN 38 mères auto-complémentaire portant la paire FRET donneur-accepteur de FAM-TAM (fluorescéine-tétraméthylrhodamine). Sa séquence est 5'-AAGGGT(TAM) CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT(FAM)T-3'. Le 38-mère auto-hybridant prend une conformation en forme d’agrafe, composée de deux épingles à cheveux connectées de 23 et 15 nucléotides, qui positionnent ses deux fluorophores à 23,8 Å l’un de l’autre. C’est nettement plus proche que le rayon de Förster pour cette paire, R0 = 55 Å8. Un tel positionnement correspond à un rendement très élevé de transfert d’énergie du donneur à l’accepteur7 : EFRET = 0,993477. En conséquence, lorsqu’elle est éclairée à la longueur d’onde d’excitation FAM (488 nm), la sonde FRET émet une fluorescence à la longueur d’onde d’émission de l’accepteur TAM (580 nm), tandis que l’émission FAM (525 nm) est supprimée.
La figure 1A montre la structure secondaire de la sonde prédite par UNAFold, avec de petites boucles aux deux sommets de l’épingle à cheveux en raison de l’obstacle stérique d’une courbure serrée. Le schéma de la détection des cassures d’ADN par la sonde FRET est présenté à la figure 1B. Il montre que la rupture de l’oligosonde par une DNase sépare sa paire FRET. Cette séparation produit des changements drastiques dans les spectres d’émission des deux fluorophores de la sonde. La figure 1C présente les spectres d’émission de la sonde avant et après son clivage et démontre que la scission de la paire FRET après le clivage de la sonde DNase II augmente l’émission du donneur à 525 nm (ID 525 nm) et diminue simultanément l’émission de l’accepteur à 580 nm (IA 580 nm). La figure 1D montre les rapports PAGE gel et FRET correspondant aux spectres d’émission. Le clivage de la sonde DNase II a produit deux larges bandes correspondant à des fragments de 12-16-mères FAM (vert) et de 20-24-mères TAM (rouge), indiquant des coupes aléatoires des 38-mères de chaque côté de T23 au voisinage de la zone de connexion entre les épingles à cheveux.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5.jpg"> 
Figure 1 : Structure et fonctionnement de la sonde FRET ratiométrique. (A) Structure secondaire prédite de la sonde FRET générée par UNAFold. (B) Représentation schématique de la sonde FRET de travail. La sonde FRET ratiométrique est un oligonucléotide 38 mères en forme d’agrafe marqué avec un donneur et un accepteur FRET (FAM) à une distance FRET effective de 23,8 Å, assurant une efficacité FRET de &gt;99 %. Le clivage de l’oligosonde par une DNase sépare la paire FRET, abolissant le FRET. (C) Spectres d’émission de la sonde FRET avant et après le clivage médié par la DNase II. Avant le clivage, l’émission de FAM est supprimée et l’émission de TAM est proéminente. Le clivage médié par la DNase sépare le FAM et le TAM, rétablissant l’émission FAM (pic de 525 nm) et abolissant l’émission TAM (chute de 580 nm). λexcitation = 488 nm. (D) Évaluation ratiométrique et électrophorétique de la sonde FRET avant et après clivage de la DNase II. Panneau supérieur : rapports FRET (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm), représentant une mesure quantitative de l’état de la sonde. Rouge : onculé ; vert : DNase II-clivé. Panneau inférieur : Gel PAGE dénaturant correspondant aux données fluorométriques. Le clivage de la DNase II donne des fragments marqués FAM (12-16 nt, vert) et des fragments marqués TAM (20-24 nt, rouge), indiquant un clivage près de la connexion entre les épingles à cheveux, flanquant T23. Le témoin Uncleaved montre une fluorescence jaune. Échelle : oligonucléotides marqués FAM et TAM correspondant aux segments 5′ et 3′ de la sonde 38-mer, avec des marqueurs fluorescents dans leurs positions d’origine. Conditions de réaction : tampon d’acétate de sodium de 10 mM (pH 5,2), sonde FRET de 1 pmol/μL, DNase II de 0,0033 U/μL, 24 h à 37 °C. RD/A = ID 525 nm/IA 580 nm ; λexcitation = 488 nm. UNAFanciennes conditions : sonde FRET 1 μM, 10 mM Na+, 0 mM Mg2+, 37 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Si les modifications apportées aux différents spectres d’émission d’essai sont évidentes, les comparaisons quantitatives entre un grand nombre de spectres d’émission nécessitent un paramètre quantitatif plus convivial et plus compact. Ce rôle est joué par le rapport FRET. La méthode de fluorescence présentée appartient à un groupe d’approches ratiométriques qui s’appuient sur les rapports directs (à deux canaux) des émissions de fluorescence des membres de la paire FRET pour leurs évaluations quantitatives 2,9.
L’approche utilise le rapport des émissions donneur/accepteur (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm), qui est lié à l’efficacité FRET et caractérise quantitativement l’état du 38-mer (brisé ou intact). Le rapport ID / IA fournit un mécanisme d’auto-normalisation qui tient compte intrinsèquement des variations de facteurs tels que la concentration de la sonde, l’intensité de l’excitation et le photoblanchiment3. L’approche ne convient qu’aux sondes FRET dont le donneur et l’accepteur sont liés au sein de la même sonde, où leur rapport est connu et constant. Pour cette raison, l’approche n’a pas besoin de prendre en compte l’excitation directe de l’accepteur ou de la diaphonie du donneur2. La stœchiométrie donneur-accepteur fixe de la sonde garantit que les rapports d’émission donneur/accepteur ne sont pas affectés par ces variations et reflètent directement l’état de la sonde. En conséquence, le rapport entre les émissions donneurs-accepteurs fournit un paramètre quantitatif de clivage de l’ADN avec normalisation du signal intégrée 2,3.
Le test utilise le rapport ID / IA (plutôt que le rapport opposé IA / ID ) car ce rapport décrit l’arrêt du FRET après le clivage de la sonde et change donc dans la même direction que l’activité de la DNase, augmentant avec l’augmentation du clivage. Ceci est illustré par la figure 1D, qui montre le rapport FRET de la sonde ratiométrique et son électrophorèse PAGE avant et après son clivage par la DNase II, tous deux correspondant aux spectres de la figure 1C. Pour démontrer la commodité, l’économie de temps et la facilité d’utilisation du test FRET ratiométrique, il a été appliqué pour découvrir et étudier l’activité DNase d’un inhibiteur de l’élastase nucléase leucocytaire (LEI) faible.
LEI nucléases faibles
L’inhibiteur de la protéase LEI est naturellement métastable, c’est-à-dire topologiquement déséquilibré. Cette caractéristique est essentielle pour son mécanisme inhibiteur. Lorsque sa protéase cible clive la boucle du site réactif LEI (RSL), la molécule inhibitrice de la protéase subit un changement conformationnel drastique, étirant mécaniquement la protéase en une forme inactive10,11. Remarquablement, cela brise et distend également la molécule LEI elle-même et démasque un site DNase cryptique qui est recouvert dans son pli natif, convertissant ainsi le LEI en une endonucléase L-DNase II active (DNase II dérivée du LEI)11,12. Le site cryptique de la DNase peut également être exposé par la dénaturation et la rupture du LEI causées par son incubation nocturne à pH 2 dans l’acide sulfurique10,13. L’utilisation de ce test FRET pour étudier le LEI a démontré que des traitements de dénaturation chimique sévères et un clivage enzymatique ciblé ne sont pas strictement nécessaires pour démasquer l’activité nucléolytique latente du LEI.
L’application et le protocole présentés de l’approche FRET ratiométrique décrivent la découverte d’une faible activité DNase intrinsèquement présente dans un LEI normal et non dénaturé. La découverte de la capacité nucléolytique intrinsèque du LEI non autorisé et son analyse ont été possibles en raison de l’aptitude du test à de longues périodes d’observation à différents niveaux de pH acide.

<table><tbody><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>Faucon</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Sonde FRET d’ADN</td><td>L’ADN de l’IDT</td><td></td><td>5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3' ; FAM &ndash ; Fluorescéine-dT ; &nbsp ; TAM &ndash ; Tétraméthylrhodamine-dT.</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo reflex numérique EVOLT</td><td>Olympe</td><td>E500</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’électrophorèse sur gel avec alimentation électrique</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEI</td><td>Novoprotéine</td><td>CJ01</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie sur gel LiCOR</td><td>LiCOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Gel PAGE pré-coulé</td><td>Invitrogen</td><td>EC68852</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon d’acétate de sodium pH 5,2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2899-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorimètre</td><td>Técan</td><td></td><td>Saffire 2</td></tr></tbody></table>

Évaluation de l’activité de la dnase par transfert d’énergie de résonance de fluorescence ratiométrique

Assessment of DNase Activity by Ratiometric Fluorescence Resonance Energy Transfer

Cette étude représentative met en évidence les avantages spécifiques de l’approche FRET ratiométrique pour l’étude des réactions enzymatiques lentes qui nécessitent de longues périodes d’observation. En particulier, l’application démontre la détection et l’analyse de l’activité DNase inhérente du LEI à l’aide d’un système FRET ratiométrique. Les résultats de cette étude sont présentés à la figure 2.
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Évaluation de l’activité de la DNase par transfert d’énergie de résonance de fluorescence ratiométrique

The present protocol describes a simple and sensitive ratiometric F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) assay for the detection and quantitative ...

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Évaluation de l’activité de la DNase par transfert d’énergie de résonance de fluorescence ratiométrique

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