Name: Visualisation de la réponse aux dommages de l’ADN dans les cellules de Purkinje à l’aide de cultures organotypiques cérébelleuses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Découvrez la réponse aux dommages de l'ADN dans les cellules de Purkinje à l'aide de cultures organotypiques cérébelleuses de souris. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de la dégénérescence cérébelleuse dans l'ataxie-télangiectasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Cellules cérébelleuses de Purkinje : réponse aux dommages à l’ADN dans les cultures organotypiques

<table><tbody>Boîte de Pétri <tr><td> réactif et équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 x 30 cm</td><td>Corning Inc.</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 35 x 10 mm</td><td>Corning Inc.</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-1L</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope adhésives</td><td>Marienfeld</td><td>48187</td><td>76 x 26 x 1 mm</td></tr><tr><td>Lames pour hachoir</td><td>TED PELLA</td><td>Modèle TC752-1</td><td>&nbsp ; Style Lames de Rasoir</td></tr><tr><td>BME</td><td>GIBCO</td><td>41010-026 500ml.&nbsp ;</td><td>Pas de L-Glut</td></tr><tr><td>Inserts de culture cellulaire</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Biological Indo.</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sans rouge phénol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138-500L</td><td>Sans Ca+,Sans Mg+</td></tr><tr><td>HBSS avec rouge phénol</td><td>Sartorius</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sérum pour cheval&nbsp ;</td><td>GIBCO</td><td>26050088</td> pince à iris <td>inactivée</td></tr><tr><td>thermiquement</td><td>CellPath</td><td>GZX-0100-00A</td><td>130mm spatule à iris dentelée émoussée</td></tr><tr><td></td><td>F.S.T</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322412-1L</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol&nbsp ;</td><td>Microscope Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Support de montage sans</td><td>GRIGENE. Ltd, Israël</td><td>K239320A</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>856177-250MG</td><td>Dichlorure de paraquat (viologène méthylique)</td></tr><tr><td>PARG- Poly(ADP-Ribose) Inhibiteur de la glycohydrolase</td><td>Tocris Bioscience, Royaume-Uni</td><td>PDD 00017273</td><td>sensible à la lumière&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tampon phosphate</td><td>Biologique Indo.</td><td>02-018-1A</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux, tissu</td><td></td><td></td><td></td>cutané</tr><tr><td>Plaques à six puits</td><td>Corning incorporées</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>Disques à hacher de rechange&nbsp ;</td><td>TED PELLA</td><td>Modèle 10180-01</td><td></td></tr><tr><td>Hachoir</td><td>à tissus McIlwain</td><td>Modèle TC752</td><td>10180-220</td></tr><tr><td>Pince à épiler, pointue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gobelets</td><td></td><td></td><td></td> urinaires</tr><tr><td><forts>Anticorps</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 âne anti Lapin IgG</td><td>&nbsp ; Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:500 ; secondaire ab ; Tampon de dilution secondaire ; &nbsp ; Incubation pendant 2 h à température ambiante</td></tr><tr><td>Protien acide fibrillaire anti-glial</td><td>Milliphore</td><td>MAB3402</td><td>1:1500 ; ab primaire ; blocage ; Hôte :souris</td></tr><tr><td>Anti-calbindin-D-28K</td><td>Swant&nbsp ;</td><td>CB300</td><td>1:2000 ; ab primaire ; bloquant ; hôte : lapin&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anti-calbindine-D-28K</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td>1:2000 ; primaire AB ; bloquant&nbsp ;</td></tr><tr><td>Réactif anti-pan-ADP-ribose</td><td>Milliphore</td><td>MABE1016</td><td>1:800 ; ab primaire ; blocage ; incubation pendant 2 h à température ambiante</td></tr><tr><td>DAPI (dichlorhydrate de 4',6-diamidine-2'-phénylindole)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4084</td><td>1:1000 ; tampon de dilution secondaire ; incubation pendant 20 min à température ambiante</td></tr></tbody></table>

visualisation de la réponse aux dommages de l’adn dans les cellules de purkinje à l’aide de cultures organotypiques cérébelleuses

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

La figure 1 illustre l’aspect général des cultures organotypiques cérébelleuses. La rangée du haut de la figure 1A montre la foliation cérébelleuse, qui est maintenue en culture, tandis que la rangée du bas montre les PC colorés pour Calbindin D-28k (vert) et les noyaux neuronaux colorés pour NeuN (rouge). Sur la figure 1B, les astrocytes des PC (en rouge) sont colorés pour la GFAP (en vert), une protéine de filament intermédiaire de type III. Les figures 2 et 3 montrent la coloration PAR observée après traitement de ces cultures avec deux agents endommageant l’ADN, tous deux oxydants forts : le bromate de potassium (concentration finale de 10 mM pendant 12 h) et le paraquat. La réponse PAR a été marquée chez les PC traités dans le folium cérébelleux par rapport au témoin.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble des cultures organotypiques cérébelleuses murines. (A) La rangée du haut illustre la foliation cérébelleuse, qui est maintenue en culture. La rangée du bas se concentre sur la couche PC. Les PC sont mis en évidence par Calbindin D-28k (vert). La coloration NeuN (en rouge) identifie les noyaux neuronaux à travers les couches. (B) Un regard plus attentif sur les PC (rouge). GFAP (vert), une protéine de filament intermédiaire de type III, qui met en évidence les astrocytes. Barres d’échelle = 968,8 μm (A, rangée supérieure), 42,1 μm (A, deuxième rangée), 72,7 μm (B, rangée supérieure), 18,2 μm (B, deuxième rangée). Abréviations : PC = cellules de Purkinje ; GFAP = protéine acide fibrillaire gliale ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig02.jpg"> Figure 2 : Coloration PAR dans une tranche cérébelleuse traitée au bromate de potassium. La tranche cérébelleuse a été traitée avec du bromate de potassium (KBrO3), un puissant agent oxydant, à une concentration finale de 10 mM pendant 12 h. Barres d’échelle = 775 μm. Abréviations : PAR = poly(ADP-ribose) ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig03.jpg"> Figure 3 : Réponse PAR dans des tranches cérébelleuses exposées au paraquat, un fort producteur d’anions superoxydes. (A) Une vue générale d’un folium cérébelleux. Notez la réponse PAR robuste, en particulier dans les PC par rapport au contrôle. (B) Un examen plus approfondi montre la réponse PAR dans les PC et d’autres types de cellules. Barres d’échelle = 193,8 μm (A), 18,2 μm (B). Abréviations : PAR = poly(ADP-ribose) ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solutions et tampons</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid"></td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solution  </td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Ingrédients</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Milieu de dissection</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant 0,5 % de D-glucose. Ajouter 0,5 mL de solution de D-glucose à 50 % à 50 mL de HBSS sans Mg2+ et Ca2+.</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Milieu de culture BME</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Mélangez 100 ml de Basal Medium Eagle (BME) contenant du rouge de phénol mais pas de L-glutamine ou d’HEPES, avec 50 ml de HBSS avec du rouge de phénol, 50 ml de sérum de cheval inactivé par la chaleur, 2 ml de D-glucose à 50 % et 1 ml de 200 mM de L-glutamine. Mélanger et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm dans un environnement stérile. Conserver à 4 °C</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solution bloquante pour l’immunomarquage</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">dans 0,1 M Tampon phosphate : ajouter 0,5 % de Triton X-100, 10 % de sérum de chèvre</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampon de dilution d’anticorps secondaire</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Tampon phosphate 0,1 M, 0,2 %Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampon de lavage</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Tampon phosphate 0,1 M, 0,2 %Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solution fixatrice</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Actenoe : méthanol (1:1 v :v)</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solution de perméabilisation</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Tampon phosphate 0,1 M, 1 %Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">La solution DAPI</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Solution mère (2 mg/mL) diluée à 1 μg/mL dans 1x PBS</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampon phosphate</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Préparez deux soulutions A et B (voir ci-dessous). Mélanger les solutions selon les rapports spécifiés ci-dessous pour obtenir un tampon de phosphate de 0,2 M. Diluez ensuite la solution 0,2M avec du DDW (1:1) pour obtenir un tampon phosphate 0,1 M (solution de travail).</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">solution A (pour 0,2 M)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">12 g de phosphate de sodium monobasique anhydre (Na2HPO4 FW 141.96) 500 mL de DDW</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solution B (pour 0,2 M)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">14,2 g de phosphate de sodium diabasique anhydre (Na2HPO4 FW 141.96) 500 mL de DDW</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Solutions mixtes pour faire 0,2 M</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Préparer 1 L : 230 mL de solution A et 770 mL de solution B</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Tampon phosphate 0,1 M</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Diluer la solution mélangée avec du DDW (1:1)</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Solutions et leur composition.

Visualisation de la réponse aux dommages de l’ADN dans les cellules de Purkinje à l’aide de cultures organotypiques cérébelleuses

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional ...

visualizing-dna-damage-response-purkinje-cells-using-cerebellar

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cette méthode décrit la génération de cultures organotypiques cérébelleux et l'effet de certains stimuli apoptotiques sur la viabilité des différents types de cellules du cervelet.

Cultures organotypiques cérébelleuse: Défis apoptotiques et détection

Nous présentons un protocole qui permet de visualiser et d'évaluer quantitativement la morphologie de l'arbre dendritique des cellules de Purkinje individuelles cultivées en culture organotypique de tranche de cervelet. Ce protocole a pour but de promouvoir les études sur les mécanismes de développement de Purkinje cellules dendritiques.

L&#39;analyse de la morphologie de Purkinje cellules dendritiques dans les cultures organotypique

Cette vidéo illustre une technique permettant d'obtenir des tranches organotypiques cérébelleuses du cerveau d'un bébé souris et de cultiver les tranches dans un milieu complété par des nutriments et des facteurs de croissance pour imiter le développement cérébelleux in vitro. De plus, des tranches cérébelleuses spécifiques sont traitées avec un composé testé, et la capacité neuroprotectrice du composé est analysée à l'aide d'une technique de coloration par immunofluorescence.

Analyse de la survie des cellules de Purkinje dans des cultures de coupes cérébelleuses organotypiques

La couche de granules cérébelleux externe est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement. Ici, nous présentons un protocole de cibler la modification génétique de cette couche au sommet de la prolifération utilisant ex électroporation et la culture de tranches de cervelet vivo à partir embryonnaires Jour 14 embryons de poulet.

Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler et cultiver les neurones de granule cérébral de souris primaire (SCT) de petits 6-7 jours vieux, transduction efficace du SCT pour la perte et gain d’études de fonction et modélisation excitotoxicité neuronale induite par le NMDA, la mort cellulaire induite par la basse-potassium, lésions de l’ADN et le stress oxydatif en utilisant le même modèle de culture.

Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Nous présentons ici une méthode pour préparer organotypique cultures tranche de cervelet de souris et de la gaine de myéline, la coloration par immunohistochimie approprié pour enquêter sur les mécanismes de la myélinisation et remyélinisation du système nerveux central.

Préparation et Immunostaining des cérébelleux Myélinisantes Organotypiques

Les cultures de tranches organotypiques sont un outil puissant pour étudier les processus neurodéveloppementaux ou dégénératifs/régénérateurs. Ici, nous décrivons un protocole qui modélise la mort neurodéveloppementale des cellules de Purkinje dans les cultures de tranche de cévedrillon de souris. Cette méthode peut bénéficier à la recherche dans la découverte de médicaments neuroprotecteurs.

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Technique requise pour visualiser le cœur battant dans la larve et...

Visualiser le cœur battant Drosophile</em

Ce protocole illustre une simple molécule unique technique de microscopie par fluorescence pour la visualisation de la réplication de l'ADN par replisomes individuelles en temps réel.

Visualisation de la réplication d&#39;ADN molécule unique par microscopie à fluorescence

Un protocole détaillé est décrit pour l'imagerie en temps réel la formation de complexes de réparation de...

Mismatch repair imagerie et les réponses cellulaires aux dommages de l&#39;ADN dans<emBacillus subtilis></em

Découvrez la réponse aux dommages de l'ADN dans les cellules de Purkinje à l'aide de cultures organotypiques cérébelleuses de souris. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de la dégénérescence cérébelleuse dans l'ataxie-télangiectasie.

Visualisation de la réponse aux dommages de l’ADN dans les cellules de Purkinje à l’aide de cultures organotypiques cérébelleuses (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation de la réponse aux dommages de l’ADN dans les cellules de Purkinje à l’aide de cultures organotypiques cérébelleuses

Explorer plus de vidéos