Développement d’un modèle de biofilm de colonie polymicrobienne pour tester les antimicrobiens dans la mucoviscidose

Notre recherche s’est concentrée sur l’utilisation de modèles polymicrobiens complexes pour comprendre les interactions complexes entre les microbes dans l’environnement de la fibrose kystique et comment cela se traduit par une tolérance accrue aux antimicrobiens. Nous espérons utiliser ces connaissances pour développer de nouvelles interventions thérapeutiques. Les progrès dans le domaine des biofilms sont stimulés par la visualisation, associée à des méthodologies de quantification et à des approches biophysiques.

Cela inclut des techniques telles que 3D OrbiSIMS qui donnent une résolution spatiale à l’échelle micro et nanométrique. Cette recherche vise à créer un modèle polymicrobien qui maintient un niveau de complexité, représentatif de ce que l’on observe dans les traitements antibiotiques chez les patients atteints de mucoviscidose. Cela permettra également d’augmenter le débit, d’obtenir des résultats plus pertinents et de s’adapter à d’autres souches et conditions.

Ce protocole offre un environnement d’essai pertinent pour les agents pathogènes de la FK. Il est robuste et a un débit relativement élevé. Il se prête également à plusieurs critères d’évaluation, ce qui permet d’entreprendre des études plus complexes.

Cette recherche a montré qu’un environnement pertinent pour la mucoviscidose modifie la sensibilité microbienne. De plus, le type de champignon présent peut également modifier la sensibilité de Pseudomonas aeruginosa, ce qui peut avoir une pertinence clinique importante. Pour commencer, prenez des cultures de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Candida albicans cultivées jusqu’à la phase exponentielle.

À l’aide d’une micropipette, transférez un millilitre de chaque culture liquide dans un tube stérile séparé de 1,5 millilitre. Centrifugez les tubes pendant deux minutes à 8 000 x g pour granuler les bactéries ou les champignons. Ensuite, à l’aide d’une pipette, aspirez le surnageant de chaque tube et mettez les granulés en suspension dans un millilitre de PBS.

Diluez les cellules de Pseudomonas aeruginosa et de Staphylococcus aureus en suspension de un à 10 dans le PBS. Ensuite, à l’aide d’un spectrophotomètre, mesurez la densité optique à une longueur d’onde de 600 nanomètres. Après avoir dilué les échantillons lavés de Candida albicans de un à 100 dans du PBS, pipeter 10 microlitres de chaque échantillon dans deux chambres individuelles d’un hémocytomètre.

Ajustez ensuite l’échantillon de Candida albicans à 1 x 10 à la puissance huit UFC par millilitre en PBS. Pour préparer l’inoculum à l’ajouter au biofilm, ajustez l’inoculum de Pseudomonas aeruginosa, de Candida albicans et de Staphylococcus aureus à l’aide de PBS. Pour les biofilms mono-espèces, pipeter 10 microlitres du microbe dilué au centre d’un disque en polycarbonate posé sur la gélose technique SCFM2 à 1,5 % en plaques à 6 puits.

Incuber la plaque statiquement à 37 degrés Celsius pendant 24 heures avant le traitement ou la perturbation. Pour les biofilms polymicrobiens, ajoutez 10 microlitres de Staphylococcus aureus et de Candida albicans l’un sur l’autre sur le même disque de polycarbonate. Incuber le disque inoculé de manière statique pendant 24 heures à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation à l’aide d’une pince stérile, transférer les disques en polycarbonate sur des plaques de gélose technique SCFM2 1,5 %. Ajoutez 10 microlitres de 1 x 10 à la puissance de dilution de quatre UFC par millilitre de Pseudomonas aeruginosa sur le biofilm préétabli de Staphylococcus aureus, Candida albicans. Incuber pendant encore 24 heures à 37 degrés Celsius.

Pour commencer, prenez le biofilm de la colonie de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Candida albicans. Ajoutez des billes de céramique d’un diamètre de 2,8 millimètres à la plaque et réticulez la plaque par UV. À l’aide d’une pince stérilisée à la flamme, transférez cinq billes de céramique dans un tube d’homogénéisation stérile de deux millilitres.

Pipeter un millilitre de PBS dans le tube d’homogénéisation de deux millilitres. Agitez les tubes pendant au moins 10 secondes ou jusqu’à ce que le biofilm ait été retiré du disque en polycarbonate, tel que déterminé par une inspection visuelle. Une fois retiré, retirez le disque en polycarbonate, puis placez les tubes avec les billes dans l’homogénéisateur et battez-les deux fois pendant 10 secondes à six mètres par seconde avec un intervalle de dix secondes entre les battements.

Versez maintenant le biofilm perturbé du tube d’homogénéisation dans un bijou de sept millilitres contenant quatre millilitres de PBS, ce qui donne un volume final de cinq millilitres. Centrifugez les tubes de l’homogénéisateur à 8 000 x g pendant deux minutes. Transférez ensuite le liquide restant dans le bijou de sept millilitres pour vous assurer que tout le liquide est transféré.

Ajoutez 200 microlitres du biofilm perturbé dans une plaque noire à fond transparent de 96 puits, puis pipetez 10 microlitres de solution de résazurine à 0,02 % dans chaque puits. Incuber le biofilm traité à la résazurine dans un lecteur de plaques à 37 degrés Celsius. Appliquez un shake orbital toutes les 30 minutes pendant 10 secondes à 200 tr/min avant de prendre des lectures fluorescentes.

Mesurez la fluorescence à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation de 540 nanomètres et d’une longueur d’onde d’émission de 590 nanomètres. Les biofilms mono-espèces nécessitaient des concentrations significativement plus faibles de méropénème et de tobramycine pour atteindre une destruction de 50 % par rapport aux biofilms polymicrobiens avec une augmentation de deux log de la concentration d’antibiotiques nécessaire pour ces derniers. La survie de Pseudomonas aeruginosa a augmenté dans les biofilms polymicrobiens avec 64 microgrammes par millilitre de tobramycine, tandis que le méropénème a montré une diminution de la survie dans des conditions similaires.

Dans les biofilms monospécifiques, une forte corrélation a été observée entre la survie de Pseudomonas aeruginosa et son activité métabolique lorsqu’il est traité à la fois avec du méropename et de la tobramycine.