Name: La microfluidique dans l’évaluation de la fonction plaquettaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Découvrez l'évaluation de la fonction plaquettaire par microfluidique pour la médecine transfusionnelle. Cette méthode simule les conditions physiologiques du flux sanguin et améliore la compréhension de l'hémostase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Toutes les recherches ont été effectuées dans le respect des directives institutionnelles. L’approbation du Bureau de protection de la recherche humaine de l’Université de Pittsburgh a été obtenue et le consentement éclairé de volontaires humains en bonne santé a été obtenu.
1. Préparation du dispositif microfluidique
<ol>
	<li>Pour fabriquer la partie PDMS de l’appareil, préparez un moule maître à l’aide de laiton via un micro-usinage à commande numérique par ordinateur (CNC). REMARQUE : Selon les dimensions du canal, des techniques de photolithographie peuvent être utilisées pour créer un moule maître. Le dispositif utilisé dans ce protocole comprend huit canaux micro-usinés parallèles d’environ 480 μm de large, 140 μm de haut à l’entrée et à la sortie du dispositif, et 40 μm de haut à la sténose du dispositif, avec une longueur de rampe vers/depuis la région sténosée d’environ 0,3 mm. La longueur des canaux est d’environ 6 mm.</li>
	<li>Avec un moule maître obtenu, versez la Base en Élastomère de Silicone (obtenue à partir du kit élastomère) dans un plat de pesée. Ajouter l’agent de durcissement du silicone (obtenu à partir du kit élastomère), qui facilite la réticulation des chaînes de polymère de silicone pour transformer le PDMS liquide en un solide durable et flexible, dans un rapport de 10:1 (agent de base) et bien mélanger le mélange.</li>
	<li>Placez le moule dans une boîte de Pétri et versez le PDMS non durci sur le moule. Placez la boîte de Pétri à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide pendant 30 min pour éliminer les bulles.</li>
	<li>Terminez le durcissement du PDMS dans le moule maître en le plaçant dans un four réglé à 70 °C pendant 90 min.</li>
	<li>Après un durcissement complet du PDMS, découpez le plâtre microfluidique à l’aide d’une lame de rasoir ou d’un scalpel. Percez des trous sur les bords des canaux (1,5 mm de diamètre des deux côtés).</li>
	<li>À l’aide de ruban adhésif de laboratoire, nettoyez la surface d’une lame de verre et le côté gravé de la fonte microfluidique. Utilisez de l’air comprimé au besoin pour enlever les débris restants.</li>
	<li>Placez la lame de verre et la coulée microfluidique avec le côté gravé vers le haut dans un nettoyant plasma. Démarrez la pompe à vide, scellez la chambre et allumez le nettoyeur plasma à haut niveau. Laissez la glissière et le PDMS dans le nettoyeur plasma pendant 30 s, puis éteignez le nettoyeur plasma et retirez l’aspirateur.</li>
	<li>Liez le coulé nettoyé au plasma et la lame de verre ensemble en appuyant doucement ensemble sur les côtés qui étaient face vers le haut dans le nettoyant plasma. Ensuite, placez le dispositif microfluidique dans un four/plaque chauffante à 70 °C pendant 10 min. REMARQUE : N’appliquez pas trop de pression lors du collage de la coulée et de la lame de verre ensemble, car cela pourrait entraîner une perte de morphologie du canal.</li>
	<li>Rincez chaque chambre avec 10 à 30 μL d’éthanol à 70 % pour stériliser et laissez sécher le dispositif microfluidique sur une plaque chauffante à 70 °C. REMARQUE : Les appareils doivent être fabriqués au moins 24 h à l’avance, mais peuvent être fabriqués des semaines ou des mois à l’avance. Les appareils doivent être conservés dans un contenant hermétique ou une boîte de Pétri couverte à température ambiante.</li>
	<li>La veille de l’expérimentation avec le dispositif microfluidique, rincez à nouveau chaque chambre avec 10 à 30 μL d’éthanol à 70 % pour stériliser et laissez sécher le dispositif microfluidique sur une plaque chauffante à 70 °C.</li>
	<li>Enduire la chambre d’un réactif de collagène fibrillaire équin de type 1 (1 mg/mL), dilué dans 0,9 % de NaCl dans un rapport volumétrique de 1:5 à travers une sortie désignée vers l’entrée désignée. Assurez-vous que la directionnalité est conservée dans une expérience. Stockez l’appareil dans un récipient fermé chaud et humide pour éviter l’évaporation du collagène enrobé dans le canal.</li>
	<li>Après 1 h, rincez avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour rincer la solution de collagène. Affleurer dans le sens opposé du revêtement. Lorsqu’il n’est pas utilisé, rangez à nouveau l’appareil dans un récipient chaud, humide et fermé.</li>
</ol>
2. Préparation de l’échantillon de sang
<ol>
	<li>Obtenez un échantillon de sang total citraté par ponction veineuse. Incuber du sang total citraté avec une solution bloquant les récepteurs FC (1:600). REMARQUE : Les échantillons de sang sont conservés à température ambiante avant et pendant l’expérimentation.</li>
	<li>Incuber du sang total citrated avec un anticorps CD41 conjugué à la fluorescence (à l’aide d’un fluorophore de votre choix) (1:600). Colorer pendant 30 min sur une bascule à nutation.</li>
	<li>Comme contrôle positif de l’inhibition plaquettaire, ajoutez du Ticagrelor, un antagoniste des récepteurs P2Y12 reconstitué dans une solution de 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine à 30 % p/v (HP-β-CD) dans du PBS. REMARQUE : Des souches de Ticagrelor allant jusqu’à 6,4 mM doivent être préparées et une dilution supplémentaire des souches de Ticagrelor dans une solution de HP-β-CD (30 % de HP-β-CD dissous dans du PBS) peut être effectuée avant l’expérimentation (des concentrations de 1 000 fois supérieures sont recommandées).</li>
	<li>Incuber l’échantillon de citrated avec du Ticagrelor (concentration finale jusqu’à 6,4 μM) pendant 30 min pour observer l’inhibition plaquettaire.</li>
	<li>Si vous mélangez le produit sanguin avec l’échantillon citraté, colorez le produit sanguin avec une solution bloquant les récepteurs FC (1:600) et un anticorps CD41 conjugué à la fluorescence (à l’aide d’un fluorophore séparé et distinct de l’échantillon citraté) (1:600).<ol>
		<li>Mélanger un équivalent volumétrique des unités de produit transfusées avec l’échantillon citraté. Par exemple, pour simuler la transfusion de 2 unités de produits plaquettaires à une personne hémorragique (environ 250 ml par produit pour un volume sanguin total de 5 000 ml), mélangez 100 μL de produit sanguin dans 1 000 μL d’échantillon de sang citraté.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immédiatement avant l’expérience, filtrez l’échantillon de sang à travers un filtre de 40 μm dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL.</li>
</ol>
3. Test de la fonction plaquettaire sous écoulement (méthode 1)
<ol>
	<li>Allumez le microscope et les logiciels associés.</li>
	<li>Réglez le niveau de la pompe de la seringue de prélèvement avec la platine du microscope. Ajustez les paramètres sur le pousse-seringue.<ol>
		<li>Calculez un débit volumétrique (Q) pour un taux de cisaillement moyen de paroi souhaité (γ) de 3 500 s-1 dans la région sténosée du canal à l’aide des équations (1) et (2)21. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq02v2.jpg" style="margin: auto;">(2) Où A est l’aire de la section transversale du canal, P est le périmètre mouillé, λ est le facteur de forme, b est le côté court du rectangle (hauteur) et a est le côté long du rectangle (largeur). REMARQUE : La valeur de 3 500 s-1 est choisie en raison du cisaillement critique VWF et se situe dans le régime artériel 7,22,23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Placez le dispositif microfluidique sur la platine du microscope. Collez les bords du dispositif microfluidique sur la platine pour éviter tout mouvement. Assurez-vous que la sortie est orientée vers l’arrière du microscope.</li>
	<li>Connectez une extrémité du tube de 1/16 » de diamètre intérieur (environ 30 cm de long) à un connecteur coudé et l’autre extrémité à une seringue de 10 ml avec un connecteur de 1/16 » de diamètre intérieur.</li>
	<li>Remplissez la seringue de PBS stérile et connectez-la au pousse-seringue.</li>
	<li>Placez le connecteur coudé dans la prise de l’appareil.</li>
	<li>Préparez des conduites d’entrée d’environ 10 cm de long avec le connecteur coudé à une extrémité et la coupe coudée à l’autre extrémité.</li>
	<li>Connectez le connecteur coudé d’entrée dans l’entrée de l’appareil.</li>
	<li>Positionnez la conduite d’entrée dans un tube de microcentrifugation à déchets sur un support coudé.</li>
	<li>Utilisez l’objectif 10x pour des dimensions de canal d’environ 500 μm de largeur et concentrez-vous sur les bords du canal du dispositif microfluidique.</li>
	<li>Amorcez les conduites avec du PBS et débarrassez le canal de tout PDMS/débris en avançant manuellement le pousse-seringue. Assurez-vous de vérifier près de l’entrée et de la sortie du canal.</li>
	<li>Ouvrez les paramètres de capture d’image enregistrés ou créez une procédure de capture d’image pour les images de séries chronologiques capturées toutes les 1 à 2 s avec un canal en fond clair et des canaux fluorescents correspondant aux anticorps CD41 fluorescents utilisés dans l’échantillon de sang.</li>
	<li>Obtenez l’échantillon de sang citrated filtré et mélangez en pipetant de haut en bas juste avant l’expérience. Placez l’échantillon sur le support de microcentrifugeuse coudé.</li>
	<li>Positionnez la ligne d’entrée dans l’échantillon.</li>
	<li>Lancez l’enregistrement de la capture d’image.</li>
	<li>Lentement, retirez la seringue pour remplir le volume mort dans la tubulure. Une fois que le sang atteint le canal, appuyez immédiatement sur le bouton de lecture de la pompe à seringue pour reprendre l’écoulement au taux de cisaillement souhaité.</li>
	<li>Ajustez la mise au point si nécessaire.</li>
	<li>Exécutez l’expérience jusqu’à ce que les plaquettes aient complètement occlus la région sténosée du dispositif microfluidique ou jusqu’à un point final expérimental (c’est-à-dire 10 min).</li>
	<li>Assurez-vous que le tube d’entrée est immergé dans l’échantillon de sang pendant toute la durée de l’expérience.</li>
	<li>Une fois l’expérience terminée, arrêtez la capture d’image et arrêtez le pousse-seringue. Enregistrez la capture d’image.</li>
	<li>Retirez le connecteur coudé d’entrée et videz le contenu du tube dans une conique de vidage. Videz également le contenu de la seringue et des conduites de sortie dans les déchets coniques.</li>
	<li>Remplacez les connecteurs d’entrée et de sortie et les tubes au besoin pour les échantillons suivants.</li>
</ol>
4. Test de la fonction plaquettaire sous écoulement avec des échantillons de faible volume (inférieur à 1 ml) (méthode 2)
<ol>
	<li>Répétez les étapes 1.1 à 1.4 comme ci-dessus.</li>
	<li>Perforer une sortie de 1,5 mm de diamètre et une entrée de 3 mm de diamètre sur les bords des canaux.</li>
	<li>Répétez les étapes 1.6 à 3.6 comme ci-dessus.</li>
	<li>Utilisez l’objectif 10x pour des dimensions de canal d’environ 500 μm de largeur et concentrez-vous sur les bords du canal du dispositif microfluidique.</li>
	<li>Nettoyez le canal de tout PDMS/débris en faisant avancer manuellement le pousse-seringue et en évacuant le liquide d’accès avec une lingette de laboratoire. Enlevez tous les débris avec du ruban adhésif de laboratoire sur le dessus du dispositif microfluidique.</li>
	<li>Avancez manuellement la pompe pour remplir le réservoir d’entrée de 3 mm avec du PBS.</li>
	<li>Ouvrez les paramètres de capture d’image enregistrés ou créez une procédure de capture d’image pour les images de séries chronologiques capturées toutes les 1 à 2 s avec un canal en fond clair et des canaux fluorescents correspondant aux anticorps CD41 fluorescents utilisés dans l’échantillon de sang.</li>
	<li>Démarrez le prélèvement sur la pompe à seringue (manuellement ou à la vitesse définie) et une fois que le PBS avance dans le canal et que la conduite de remplissage dans le réservoir descend, interrompez le retrait sur la pompe.</li>
	<li>Retirez l’excès de PBS du réservoir à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Lancez la capture d’image.</li>
	<li>Pipeter l’échantillon de sang dans le réservoir (environ 40 μL) et démarrer immédiatement la seringue de prélèvement. Assurez-vous que le flux démarre. REMARQUE : Si le moteur du pousse-seringue pour le retrait n’a pas été amorcé à l’étape 4.8, le débit ne démarrera pas immédiatement et l’expérience doit être répétée.</li>
	<li>Remplissez le réservoir de sang pendant toute la durée de l’expérience, en vous assurant qu’aucune poche d’air ne pénètre dans le canal.</li>
	<li>Exécutez l’expérience jusqu’à ce que les plaquettes aient complètement occlus la région sténosée du dispositif microfluidique ou jusqu’à un point final expérimental (c’est-à-dire 10 min).</li>
	<li>Une fois l’expérience terminée, arrêtez la capture d’image et arrêtez le pousse-seringue. Enregistrez la capture d’image.</li>
	<li>Retirez l’excès de sang dans le réservoir par pipetage. Videz le contenu du tube de prélèvement dans un tube conique de déchets.</li>
	<li>Remplacez les connecteurs et les tubes au besoin pour les échantillons suivants.</li>
</ol>
5. Décontamination
<ol>
	<li>Nettoyez les conduites d’entrée et de sortie du sang en rinçant dans une solution d’eau de Javel à 10 %.</li>
	<li>Si tous les canaux du dispositif microfluidique ont été utilisés, jetez le dispositif dans le conteneur de déchets biologiques dangereux Sharps. REMARQUE : Tous les déchets biologiques doivent être éliminés de manière appropriée avec les déchets biologiques.</li>
</ol>
6. Analyse d’images
<ol>
	<li>Exportez les images des expériences cinétiques à l’aide d’un logiciel en cliquant sur Fichier | Exportation/Importation | Exportation.</li>
	<li>Sélectionnez les paramètres suivants : type de fichier : TIFF (Tagged Image File Format) ; compression : LZW ; cochez Données d’origine et Décalage du pixel ; décochez Appliquer la courbe d’affichage et la couleur du canal ; cochez Définir le sous-ensemble (Région, Région Rectangle, puis sélectionnez la zone du canal avec une mesure de largeur et de hauteur conservée entre les conditions). Exportez vers le dossier de votre choix et cochez la case Créer un dossier.</li>
	<li>Notez les valeurs expérimentales ci-dessous sur le logiciel : démarrer l’image lorsque le sang pénètre dans le canal ; fréquence d’images (Info, Séries chronologiques).</li>
	<li>Mesurez l’intensité de fluorescence moyenne normalisée de chaque image dans une expérience à l’aide du code Matlab fourni dans le fichier supplémentaire 1, en modifiant les entrées suivantes pour chaque expérience : image de début/image de fin en fonction de la longueur de l’expérience (assurez-vous que la longueur de l’expérience est conservée entre les conditions) ; le nom de l’expérience/le nom du dossier ; recadrage des paramètres X, Y, H et W. Exécutez le code une fois pour le canal fluorescent plaquettaire du récepteur et une fois pour le canal fluorescent plaquettaire du produit. Indiquez les valeurs normalisées de l’IFM (colonne 2) et de l’AUC normalisée (normalisées à l’image de départ). Soustrayez la valeur de la durée de l’expérience de la valeur AUC normalisée.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Plateforme d’évaluation de la fonction plaquettaire dans les traumatismes et les transfusions

<ol><li>Moore, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trauma-induced+coagulopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Trauma-induced coagulopathy.</a> Nat Rev Dis Primers. 7 (1), 1-23 (2021).</li>
<li>Vulliamy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+platelet+behavior+after+major+trauma%3A+adaptive+or+maladaptive%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Alterations in platelet behavior after major trauma: adaptive or maladaptive.</a> Platelets. 32 (3), 295-304 (2021).</li>
<li>Starr, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+injury+and+shock+driven+effects+on+ex+vivo+platelet+aggregometry%3A+A+cautionary+tale+of+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Identification of injury and shock driven effects on ex vivo platelet aggregometry: A cautionary tale of phenotyping.</a> J Trauma Acute Care Surg. 89 (1), 20-28 (2020).</li>
<li>Kutcher, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+platelet+dysfunction+after+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Characterization of platelet dysfunction after trauma.</a> J Trauma Acute Care Surg. 73 (1), 13-19 (2012).</li>
<li>Yakusheva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+vessel+injuries+initiating+hemostasis+generate+high+shear+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Traumatic vessel injuries initiating hemostasis generate high shear conditions.</a> Blood Adv. 6 (16), 4834-4846 (2022).</li>
<li>Colace, T. V., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+von+Willebrand+factor+elongation+and+fiber+formation+on+collagen+during+acute+whole+blood+exposure+to+pathological+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observation of von Willebrand factor elongation and fiber formation on collagen during acute whole blood exposure to pathological flow.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (1), 105-113 (2013).</li>
<li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+Willebrand+factor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von Willebrand factor fibers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (19), 7899-7903 (2007).</li>
<li>Savage, B., Almus-Jacobs, F., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synergy+of+multiple+substrate-receptor+interactions+in+platelet+thrombus+formation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specific synergy of multiple substrate-receptor interactions in platelet thrombus formation under flow.</a> Cell. 94 (5), 657-666 (1998).</li>
<li>Savage, B., Saldívar, E., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+platelet+adhesion+by+arrest+onto+fibrinogen+or+translocation+on+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor.</a> Cell. 84 (2), 289-297 (1996).</li>
<li>Ruggeri, Z. M., Mendolicchio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+mechanisms+in+platelet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adhesion mechanisms in platelet function.</a> Circ Res. 100 (12), 1673-1685 (2007).</li>
<li>Chernysh, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinctive+structure+and+composition+of+arterial+and+venous+thrombi+and+pulmonary+emboli%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The distinctive structure and composition of arterial and venous thrombi and pulmonary emboli.</a> Sci Rep. 10 (1), 5112(2020).</li>
<li>Holcomb, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfusion+of+plasma%2C+platelets%2C+and+red+blood+cells+in+a+1%3A1%3A1+vs+a+1%3A1%3A2+ratio+and+mortality+in+patients+with+severe+trauma%3A+The+PROPPR+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Transfusion of plasma, platelets, and red blood cells in a 1:1:1 vs a 1:1:2 ratio and mortality in patients with severe trauma: The PROPPR randomized clinical trial.</a> JAMA. 313 (5), 471-482 (2015).</li>
<li>Shea, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doing+more+with+less%3A+low-titer+group+O+whole+blood+resulted+in+less+total+transfusions+and+an+independent+association+with+survival+in+adults+with+severe+traumatic+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Doing more with less: low-titer group O whole blood resulted in less total transfusions and an independent association with survival in adults with severe traumatic hemorrhage.</a> J Thromb Haemost. 22 (1), 140-151 (2024).</li>
<li>Cardenas, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+transfusions+improve+hemostasis+and+survival+in+a+substudy+of+the+prospective%2C+randomized+PROPPR+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Platelet transfusions improve hemostasis and survival in a substudy of the prospective, randomized PROPPR trial.</a> Blood Adv. 2 (14), 1696-1704 (2018).</li>
<li>Sperry, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prehospital+plasma+during+air+medical+transport+in+trauma+patients+at+risk+for+hemorrhagic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Prehospital plasma during air medical transport in trauma patients at risk for hemorrhagic shock.</a> N Engl J Med. 379 (4), 315-326 (2018).</li>
<li>Meyer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Every+minute+counts%3A+Time+to+delivery+of+initial+massive+transfusion+cooler+and+its+impact+on+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Every minute counts: Time to delivery of initial massive transfusion cooler and its impact on mortality.</a> J Trauma Acute Care Surg. 83 (1), 19-24 (2017).</li>
<li>Shea, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-stored+platelet+hemostatic+capacity+is+maintained+for+three+weeks+of+storage+and+associated+with+taurine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Cold-stored platelet hemostatic capacity is maintained for three weeks of storage and associated with taurine metabolism.</a> J Thromb Haemost. 22 (4), 1154-1166 (2024).</li>
<li>Sperry, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cold+stored+platelet+transfusion+following+severe+injury%3A+a+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Early cold stored platelet transfusion following severe injury: a randomized clinical trial.</a> Ann Surg. 280 (2), 212-221 (2024).</li>
<li>Schoeman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+model+of+hemostasis+sensitive+to+platelet+function+and+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A microfluidic model of hemostasis sensitive to platelet function and coagulation.</a> Cell Mol Bioeng. 10 (1), 3-15 (2017).</li>
<li>Sakurai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengineered+vascularized+bleeding+model+that+integrates+the+principal+components+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis.</a> Nat Commun. 9 (1), 509(2018).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+non-Newtonian+flow+behavior+in+ducts+of+unusual+cross+section%5BTitle%5D)+AND+%22Ind+Eng+Chem+Fundamentals%22%5BJournal%5D)">Predicting non-Newtonian flow behavior in ducts of unusual cross section.</a> Ind Eng Chem Fundamentals. 11 (4), 524-528 (1972).</li>
<li>Kim, D., Bresette, C., Liu, Z., Ku, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occlusive+thrombosis+in+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Occlusive thrombosis in arteries.</a> APL Bioeng. 3 (4), 041502(2019).</li>
<li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+and+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li>
<li>Sorrells, M. G., Neeves, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+and+absorption+of+collagen+peptides+to+polydimethlysiloxane+and+its+influence+on+platelet+adhesion+flow+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Adsorption and absorption of collagen peptides to polydimethlysiloxane and its influence on platelet adhesion flow assays.</a> Micromachines. 11 (1), 62(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td>4917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Space Saver Dessiccateurs sous vide</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Agitateur numérique à plaque chauffante</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB30786161</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur à dessiccation</td><td>Fischer Scientific</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>OHAUS Scout Balance Balance</td><td>Uline</td><td>H-5852</td><td></td></tr><tr><td>Four</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0520</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G (115V)</td><td></td></tr><tr><td>Pousse-seringue (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>883015</td><td></td></tr><tr><td>Zen 3.4</td><td>Zeiss</td><td>Blue edition</td><td>Logiciel</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/16 inch ID - Barbed Elbow Connectors</td><td>Qosina</td><td>11691</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 10 mL</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxypropyl-&beta ;-cyclodextrin</td><td>Cayman Chemicals</td><td>16169</td><td>30 % Dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate</td></tr><tr><td>Filtres de 40 microns</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td></td>NC1469671</tr><tr><td>anticorps CD41</td><td>Novus Biologicals</td><td>&nbsp ; NB100-2614</td><td>Rapport 1:600 dans le sang total</td></tr><tr><td>Réactif de collagène Chrono-Par</td><td>Chrono Log Corporation</td><td>385</td><td>Rapport 1:5 dans la microscopie électronique saline à 0,9 %</td></tr><tr><td>Sciences Poinçon de biopsie Miltex avec piston, 3,0 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0856599</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifugeuse à capuchon instantané SafeLock Tubes, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Essendant 121oz. Clorox Eau de Javel germicide</td><td>Fischer Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td>70 %</td></tr> <tr><td>Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Gaz comprimé</td><td>Supra</td><td>1381978</td><td></td></tr><tr><td>Human TruStain</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>rapport 1:600 dans le sang total</td></tr><tr><td>LevGo smartSpatula Spatule jetable en polypropylène</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-001-017</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel de sécurité</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-718</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Millipore</td><td>567442</td><td>0,90 %</td></tr><tr><td>Sartorius Bateaux de pesage en polystyrène</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-744</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles Superslip - Superslip No. 1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-055</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>Polydiméthylsiloxane (PDMS)</td></tr><tr><td>Ticagrelor</td><td>Cayman Chemicals</td><td>15425</td><td></td></tr><tr><td>Tygon PVC Clear Tubing 1/16 » ID, 1/8 » OD, 50 ft length</td><td>McMaster-Carr</td><td>6516T11</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Machinable 360 Brass Barre</td><td>McMaster-Carr</td><td>8954K721</td><td>Pour la fabrication de moules</td></tr><tr><td>maîtres Vacutainers</td><td>BD</td><td>363083</td><td></td></tr><tr><td>World Instrument Reusable Biopsy Punch, 1.5mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1215626</td><td></td></tr></tbody></table>

la microfluidique dans l’évaluation de la fonction plaquettaire

Microfluidics in Assessing Platelet Function

Les expériences microfluidiques suivant l’utilisation de cette méthode devraient montrer la formation de thrombus riches en plaquettes dans la région de sténose du canal d’écoulement (Figure 1). La figure 1A illustre des résultats représentatifs où les plaquettes fonctionnelles ont formé un thrombus dans la région sténosée du canal pour bloquer le flux sanguin à travers le canal. Les courbes d’intensité moyenne de fluorescence (MFI) des images cinétiques prises pendant la durée de l’expérience illustrent un décalage, une croissance et une phase de plateau de l’incorporation plaquettaire dans le thrombus en croissance (Figure 2A,C). L’augmentation des concentrations d’un antagoniste de P2Y12, le ticagrélor, diminue l’IMF plaquettaire ainsi que l’aire sous la courbe calculée (AUC) des courbes MFI (Figure 2B,D). Des temps d’incubation plus longs sont nécessaires (30 min contre 5 min) pour observer un dysfonctionnement plaquettaire prononcé, conformément à une relation dose-réponse plus prononcée utilisant l’agrégométrie d’impédance du sang total après une incubation de Ticagrelor de 30 minutes par rapport à une incubation de 5 min (figure supplémentaire S1). Dans différentes conditions de véhicule, des effets similaires de l’inhibition de P2Y12 en fonction du temps ont été observés dans le modèle microfluidique (figure supplémentaire S2).
La visualisation de deux populations plaquettaires dans la méthode de réanimation hémostatique simulée illustre l’incorporation des deux populations plaquettaires dans le thrombus (Figure 3A). L’incorporation des deux populations de plaquettes dans leur signal fluorescent correspondant peut être quantifiée cinétiquement sur la durée de l’expérience via des mesures MFI (Figure 3B). Des pentes plus raides dans la phase de croissance ainsi que des mesures MFI accrues démontrent une fonctionnalité plaquettaire et un potentiel hémostatique accrus, ce qui peut être observé dans la quantification des plaquettes receveuses lorsque l’échantillon de sang a été induit par un dysfonctionnement plaquettaire via l’inhibition de P2Y12, puis dans la réanimation simulée en mélangeant du sang total autologue frais dans un rapport volumétrique de 1:10 coloré avec un fluorophore plaquettaire distinct. Avec le mélange autologue de sang total, une plus grande quantité de plaquettes a été incorporée à partir du produit transfusé simulé par rapport à un produit plaquettaire d’aphérèse au jour 5 de stockage à température ambiante, ce qui a montré une incorporation minimale du produit dans le thrombus en formation. Le mélange de produits plaquettaires à température ambiante au jour 5 a également montré une incorporation de plaquettes receveurs plus faible par rapport au mélange avec du sang total autologue frais (figure 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig01.jpg"> 
Figure 1 : Représentation des tests de la fonction plaquettaire à l’aide de la microfluidique. (A) Un dispositif expérimental microfluidique schématique pour l’analyse de la fonction plaquettaire à l’aide d’échantillons de sang de faible volume est présenté, y compris une pompe à seringue de prélèvement aspirant le sang à travers une chambre d’écoulement sténosée, permettant la capture d’images en temps réel. (B) Une vue latérale d’une chambre d’écoulement sténosée est représentée, y compris une surface recouverte de collagène sur laquelle les plaquettes adhèrent, s’activent et s’agrègent, entraînant un thrombus croissant dans la région sténosée. (C) Capture d’image en temps réel d’un échantillon de sang citrated sous flux dans un canal microfluidique sténosé (3 500 s-1) et d’un thrombus en croissance formé sur 300 s. Barres d’échelle = 200 μm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig02.jpg"> 
Figure 2 : Réduction des modifications du pli plaquettaire de l’IFM et de l’aire sous la courbe après 30 min d’incubation avec l’antagoniste de P2Y12 Ticagrelor. (A) L’incubation avec l’antagoniste de P2Y12 pendant seulement 5 min démontre des phases de latence légèrement prolongées des courbes de l’IFM et (B) de légères diminutions de l’AUC de l’IFM. (C) L’incubation pendant 30 minutes avec l’antagoniste P2Y12 entraîne des phases de latence prolongées et des valeurs MFI réduites ainsi que (D) un dysfonctionnement plus robuste démontré par l’ASC MFI. Les points de données individuels représentent les répétitions biologiques et la moyenne ±écart-type est indiquée. Abréviations : MFI = intensité moyenne de fluorescence ; AUC = aire sous la courbe ; HP-β-CD = 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig03.jpg"> 
Figure 3 : Mélange de produits sanguins avec inhibition coagulopathique de P2Y12 dans l’échantillon du receveur, simulant un dysfonctionnement plaquettaire du patient, dans la chambre microfluidique. (A) Unité plaquettaire d’aphérèse (plasma, stockage 7 jour) (CD41 en cyan) mélangée dans un rapport de 1:10 avec du sang citrated pré-incubé avec 0,8 μM de Ticagrelor pendant 30 min (CD41 en rouge). (B) Courbes d’intensité de fluorescence moyennes normalisées représentatives de l’échantillon de sang du receveur recevant soit une unité plaquettaire d’aphérèse (jour de stockage 5), soit du sang total frais autologue (rapport 1:10) avec la cinétique plaquettaire du receveur au fil du temps. Le sang citrated du receveur a été pré-incubé avec 0,8 μM de Ticagrelor pendant 30 min avant d’être mélangé à des produits sanguins. (C) Image représentative de la pile z d’un dispositif modifié collé à une lamelle pour la microscopie confocale. Le produit plaquettaire d’aphérèse a été mélangé à un échantillon de sang thrombocytopénique dans un rapport volumétrique de 1:5 (produit :sang) en plus d’un anticorps anti-facteur de von Willebrand (1:600). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Code Matlab pour l’analyse d’images. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/ImageReader_Jove_Supplemental.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S1 : Aggrégométrie d’impédance du sang total en fonction du temps de l’inhibition de P2Y12 avec le Ticagrelor. L’incubation pendant 30 min entraîne une relation dose-réponse plus prononcée par rapport à 5 min. Les solutions pour véhicules et médicaments ont été utilisées à 0,1 % v/v. Les points de données individuels représentent les répétitions biologiques et la moyenne ±écart-type est indiquée. Abréviations : AUC = aire sous la courbe ; HP-β-CD = 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S2 : Inhibition de P2Y12 dépendante du temps avec Ticagrelor dans un modèle microfluidique de la fonction plaquettaire. Les courbes représentatives de l’IFM et les valeurs de l’aire sous la courbe pour les répétitions techniques d’un donneur sain individuel sont indiquées avec le véhicule de l’éthanol (1 % v/v) utilisé pour la solubilité du médicament. Abréviations : MFI = intensité moyenne de fluorescence ; AUC = aire sous la courbe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%202.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

La microfluidique dans l’évaluation de la fonction plaquettaire

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying ...

microfluidics-in-assessing-platelet-function

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

La cascade adhésion des plaquettes a lieu en présence du cisaillement, un facteur non pris en compte dans conventionnelle (statique) du bien-plaque de tests. Cet article rend compte d'un test d'agrégation plaquettaire en utilisant une plaque de microfluidique bien le format d'émuler les conditions physiologiques de flux de cisaillement.

L&#39;adhésion des plaquettes et l&#39;agrégation sous flux en utilisant des cellules de débit microfluidique

La transfusion de plaquettes et l’hémostase ont été modélisées à l’aide de la reconstitution sanguine et des chambres de flux microfluidique pour étudier la fonction des plaquettes de banque de sang. Les données démontrent les conséquences de la lésion de stockage plaquettaire sur l’hémostase, in vitro.

Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion<em&gt; In vitro</em

Cet article décrit un modèle expérimental d'hémostase qui permet de mesurer simultanément la fonction plaquettaire et de la coagulation. Plaquettaires et de la fluorescence de la fibrine est mesurée en temps réel et le taux de plaquettes d'adhérence, la vitesse de coagulation, et le début de la coagulation sont déterminés. Le modèle est utilisé pour déterminer les propriétés des plaquettes procoagulantes sous flux de concentrés pour la transfusion.

A microfluidique débit Chambre Modèle pour Platelet Transfusion et Hémostase mesures Platelet Déposition et la formation de fibrine en temps réel

Nous décrivons un procédé simple pour l'isolement des plaquettes lavées à partir de sang humain suivie par des mesures de l'agrégation plaquettaire induite par l'agoniste par turbidimétrie. À titre d'exemple, nous appliquons cette méthode pour étudier la réponse d'agrégation des plaquettes sanguines humaines au collagène après une pré-incubation avec l'inhibiteur du canal Pannexin1 bleu brillant FCF.

Turbidimétrie sur Human Washed: L&#39;effet Plaquettes du Pannexin1 inhibiteur bleu brillant FCF sur l&#39;agrégation induite par le collagène

Ce travail décrit une méthode à base de microscopie à fluorescence pour l'étude de l'adhérence plaquettaire, de la propagation et de la sécrétion sous l'écoulement. Cette plate-forme polyvalente permet l'étude de la fonction plaquettaire pour la recherche mécanistique sur la thrombose et l'hémostase.

Imagerie en cellules vivantes de la dégranulation et de la sécrétion de plaquettes sous le flux

Nous présentons un modèle in vitro de maladie vasculaire pour étudier des interactions de sang entier avec l’endothélium patient-dérivé. Ce système permet l’étude des propriétés thrombogéniques des cellules endothéliales primaires dans diverses circonstances. La méthode est particulièrement adaptée pour évaluer la thrombogénicité in situ et la thérapie anticoagulation pendant les différentes phases de la coagulation.

Modèle de maladie microfluidique in vitro pour étudier les interactions endoteléliales du sang entier et la dynamique des caillots sanguins en temps réel

Un protocole pour un nouveau test fonctionnel dynamique multiparamètre des plaquettes à l’aide d’un biocapteur capacitif est présenté ici. Cette approche, conçue dans un microenvironnement semi-rigide pour améliorer la pertinence physiologique, fournit trois paramètres de sortie sensibles à la numération plaquettaire, aux forces de stimulation et aux voies d’activation.

Évaluation dynamique multiparamétrique de la fonction plaquettaire à l’aide d’un biocapteur capacitif

La formation de plaquettes procoagulantes a été corrélée à un risque accru de thrombose. Voici un protocole précis d’isolement des plaquettes lavées du sang humain, destiné à quantifier l’exposition à la phosphatidylsérine et la libération de microvésicules, qui sont des caractéristiques distinctives des plaquettes procoagulantes.

Caractérisation des plaquettes procoagulantes par mesure de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules à partir de plaquettes humaines purifiées

Ce travail décrit un test microfluidique qui utilise la contrainte de cisaillement pour déclencher la formation de thrombus dans le sang et caractérise le thrombus par plusieurs dimensions de lecture. Ce test peut mesurer la tendance prothrombotique des échantillons sanguins, et est donc utile pour le diagnostic des maladies, la découverte de médicaments, ainsi que pour les études mécanistes fondamentales liées à la thrombose.

Analyse de profilage de thrombus : une plateforme basée sur la microfluidique pour caractériser de manière exhaustive la thrombogenèse biomécanique

Une procédure non invasive pour évaluer la fonction endothéliale est démontrée en utilisant les 2000 Endo-PAT.

Évaluer la fonction endothéliale Vasodilatateur avec le 2000 Endo-PAT

Découvrez l'évaluation de la fonction plaquettaire par microfluidique pour la médecine transfusionnelle. Cette méthode simule les conditions physiologiques du flux sanguin et améliore la compréhension de l'hémostase.

La microfluidique dans l’évaluation de la fonction plaquettaire

Explorer plus de vidéos