Optimisation de la préparation des échantillons pour la microscopie électronique cryogénique
11 avril 2025
Ce protocole présente une méthode pratique utilisant Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) comme exemple pour traiter la distribution inégale des particules par l’optimisation de la préparation des échantillons, fournissant une référence aux chercheurs pour élucider efficacement les structures macromoléculaires à l’aide de la microscopie électronique cryogénique (cryo-EM).
La préparation d’échantillons cryogéniques est confrontée à des défis qui peuvent limiter son efficacité, en particulier la distribution inégale des particules. Ce problème conduit souvent à une mauvaise résolution et à une précision réduite dans les nouvelles structures protéiques construites. Diverses approches expérimentales sont utilisées pour surmonter la distribution inégale des particules, notamment l’ajout de détergents ou d’imitations de membranes à l’échantillon, la modification du film de support de la grille et l’inclinaison d’une étape spécifique lors de la collecte de données.
Ce protocole analyse une méthode pratique simple pour traiter la distribution inégale des particules en optimisant la préparation des échantillons, fournissant notre référence aux chercheurs pour illustrer efficacement les structures des macromolécules à l’aide de cryogène. Pour commencer, collectez les fractions protéiques regroupées contenant la petite protéine de choc thermique MJ 16.5. Utilisez des filtres centrifuges avec une coupure de poids moléculaire de 50 kilodaltons pour concentrer les fractions à quatre degrés Celsius à environ 65 milligrammes.
Après la concentration, centrifuger l’échantillon à 16 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les agrégats. Aliquote de volumes de 50 microlitres de surnageant dans des tubes PCR à paroi mince de 0,2 millilitre. Pour la microscopie électronique à transmission, décongelez deux tubes de protéines congelés sur de la glace.
Une fois décongelé, retournez le tube plusieurs fois pour mélanger. Ensuite, centrifugez la solution protéique à 16 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les agrégats. Ensuite, injectez le surnageant dans une colonne de chromatographie d’exclusion stérique et collectez des fractions d’élution de 0,5 millilitre.
Collectez les fractions éluciennes correspondant au pic, présentant l’absorbance ultraviolette la plus élevée à 280 nanomètres. Pour l’échange de tampon, à l’aide d’une paire de ciseaux, coupez une membrane de dialyse en morceaux de 30 x 30 millimètres. Incuber les morceaux dans de l’eau distillée ou des solutions tampons pour les équilibrer.
Ensuite, ajoutez 55 microlitres de solution protéique dans une chambre avec des boutons de microdialyse de 50 microlitres. Tenez la membrane de dialyse verticalement à l’aide d’une pince et touchez doucement un bord de la membrane contre du papier de soie pour drainer l’excès de liquide. Couvrez soigneusement le bouton de microdialyse avec la membrane.
Placez le joint torique sur la membrane de dialyse et roulez-le doucement dans la rainure sur le bord du bouton. Immergez chaque bouton de dialyse dans un bécher séparé contenant le tampon de destination, le côté de la membrane vers le haut. À l’aide d’une seringue munie d’une aiguille fine, percez soigneusement la membrane et récupérez la solution protéique de la chambre de microdialyse.
Chargez cinq microlitres de l’échantillon à une concentration de 20 à 120 nanogrammes par millilitre sur une grille de décharge luminescente. Préparez trois gouttes d’eau de 50 microlitres chacune sur une feuille de film de paraffine. Frottez la surface de la grille contre les gouttes d’eau pour laver l’échantillon.
Chargez maintenant cinq microlitres de solution d’acétate d’urinoir filtrée à 1 % sur la grille et pipetez immédiatement la solution d’acétate d’urinoir. Chargez encore cinq microlitres de la solution d’acétate d’urinoir sur la grille. Touchez doucement le côté pince à épiler de la grille avec du papier filtre pour éliminer l’excès de solution de coloration et laissez sécher la grille.
Montez la pince à épiler et la grille de décharge lumineuse sur l’instrument. Chargez ensuite quatre microlitres de l’échantillon sur le côté carbone de la grille. Lancez le processus de congélation par immersion.
Pour préparer les grilles à charger sur le microscope électronique à transmission, ou MET, placez d’abord une boîte de grille contenant des grilles vitrifiées dans la station d’assemblage de la grille automatique et dévissez le couvercle d’une boîte de grille contenant des grilles vitrifiées. Placez l’anneau de grille automatique dans l’espace de découpe désigné au poste d’assemblage. Déplacez avec précaution la grille vitrifiée de la boîte de grille et insérez-la dans l’anneau de grille automatique.
Alignez maintenant le disque pour positionner l’ouverture circulaire sur le dessus de l’anneau de grille automatique et de l’ensemble de grille. Pour fixer la grille dans l’anneau de grille automatique, placez l’outil d’insertion du clip C sur le dessus de la grille et appuyez doucement pour fixer le clip C à l’intérieur. Faites pivoter le disque vers l’arrière et déplacez les grilles assemblées dans la boîte de stockage à grille automatique.
Assemblez la station de chargement de la cassette et refroidissez-la avec de l’azote liquide. Placez la boîte de stockage à réseau automatique dans la station de chargement. Déplacez l’ensemble de grille de la boîte de rangement de la grille automatique vers la cassette.
À l’aide de la poignée, placez la cassette dans la capsule du chargeur automatique. Vérifiez la goupille du chargeur automatique pour confirmer sa liberté de mouvement et assurez-vous qu’elle n’est pas gelée. L’accumulation de particules en réseaux a été observée sur toutes les grilles testées, quelles que soient les conditions tampons ou les modifications de charge de surface.
Une concentration protéique plus élevée combinée à des grilles chargées négativement dans neuf millimolaires de mobstress, 50 millimolaires de chlorure de sodium et 0,1 millimolaire de tampon EDTA a permis d’obtenir la distribution souhaitée de particules uniques dans les trous de grille, réduisant ainsi la formation de réseaux de protéines. Cette condition optimisée a conduit à une valeur élevée de rapport de surface conique FSC de 0,80 et à une valeur SCF de 0,859, confirmant une distribution uniforme des particules.
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Aperçu
Ce protocole présente une méthode pratique pour traiter la répartition inégale des particules dans la préparation des échantillons en microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) en utilisant Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) comme exemple. Il fournit une référence aux chercheurs pour élucider efficacement les structures macromoléculaires.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Microscopie électronique cryogénique
- Optimisation de la préparation des échantillons
- Analyse des structures macromoléculaires
Contexte
- La préparation d'échantillons cryogéniques fait face à des défis tels que la répartition inégale des particules.
- Une faible résolution et précision dans les structures protéiques construites peuvent résulter de ce problème.
- Différentes approches expérimentales existent pour atténuer la répartition inégale des particules.
- Les détergents, les mimétiques de membrane et les modifications du support de grille sont des stratégies couramment utilisées.
Objectif de l'étude
- Analyser une méthode pratique pour optimiser la préparation des échantillons.
- Fournir une référence aux chercheurs en cryo-EM.
- Illustrer efficacement les structures macromoléculaires.
Méthodes utilisées
- Collecter les fractions protéiques regroupées contenant la petite protéine de choc thermique 16.5 de MJ.
- Utiliser des filtres centrifuges avec un seuil de poids moléculaire de 50 kilodaltons.
- Concentrer les fractions à quatre degrés Celsius à environ 65 milligrammes.
- Mettre en œuvre diverses approches expérimentales pour améliorer la répartition des particules.
Résultats principaux
- Le protocole traite efficacement la répartition inégale des particules.
- Une meilleure préparation des échantillons conduit à une meilleure résolution en cryo-EM.
- Fournit une méthode fiable pour les chercheurs pour analyser les structures macromoléculaires.
- Démontre l'importance de l'optimisation de l'échantillon dans les techniques cryogéniques.
Conclusions
- L'optimisation de la préparation des échantillons est cruciale pour une cryo-EM efficace.
- La méthode présentée sert de référence précieuse pour les chercheurs.
- Traiter la répartition inégale des particules améliore l'élucidation structurelle.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Optimizing cryo-EM sample preparation directly impacts the reliability of high-resolution macromolecular structure determination, a critical inflection point in early drug discovery and target validation. Addressing uneven particle distribution enhances predictive confidence in structural data, supporting downstream screening and mechanistic de-risking. This workflow refinement is highly relevant for biopharma teams seeking robust, reproducible structural insights to inform portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables accurate visualization of protein conformations for functional target validation.
- Reduces structural ambiguity, supporting mechanistic de-risking in target selection.
- Improves confidence in structure-based hypothesis testing and pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of homogeneous samples for reproducible cryo-EM assays.
- Supports standardization of grid preparation, enhancing assay scalability and reliability.
- Enables quantitative assessment of particle distribution, critical for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Provides structural continuity from discovery to preclinical validation when disease-relevant targets are studied.
- Improves risk-adjusted advancement by ensuring structural data quality for candidate selection.
- Supports alignment of structural outputs with translational biomarker strategies when applicable.
Pipeline & Workflow Integration
This sample preparation optimization fits at the interface of early discovery and lead identification, ensuring structural data integrity before downstream screening and preclinical modeling.
- Discovery Biology: Enhances hypothesis testing by minimizing artifacts from uneven particle distribution.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality grids for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative metrics (e.g., FSC area ratio, SCF value) to benchmark sample quality.
- Translational Research: Supports continuity of structural insights into preclinical workflows when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for repeated use across targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization of cryo-EM sample preparation.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by ensuring high-quality structural data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, grid preparation, and cryo-EM instrumentation.
- Demands access to high-quality centrifugal filters, chromatography, and vitrification equipment.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling and grid preparation protocols.
- May require adaptation for different protein classes or buffer conditions.
- Effectiveness depends on careful control of protein concentration and grid surface properties.
