Name: Culture gliale entérique équine et application à l’étude d’un mécanisme inflammatoire neuronal dans les coliques équines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Découvrez l'isolation de cellules gliales entériques équines pour étudier leur rôle dans les complications postopératoires inflammatoires. Cette méthode permet d'évaluer la fonction barrière intestinale et de développer des approches thérapeutiques.

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<meta charset="utf8"></head><body>Étude des interactions gliales-épithéliales entériques dans l’inflammation liée aux coliques

<ol><li>Tinker, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+equine+colic+incidence+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Prospective study of equine colic incidence and mortality.</a> Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).</li>
<li>Morton, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+and+postoperative+factors+influencing+short-term+survival+of+horses+following+small+intestinal+resection%3A+92+cases+%281994-2001%29%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001).</a> Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).</li>
<li>French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+surgical+colic%3A+risk+factors+for+postoperative+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications.</a> Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).</li>
<li>Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+the+local+inflammatory+response+in+the+intestinal+mucosa+and+muscularis+of+horses+undergoing+small+intestinal+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection.</a> Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).</li>
<li>Sheats, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+equine+SIRS%2C+sepsis%2C+and+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils.</a> Front Vet Sci. 6, 69(2019).</li>
<li>Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+and+postoperative+gastrointestinal+tract+dysfunction%3A+pathogenic+mechanisms+and+novel+treatment+strategies+beyond+colorectal+enhanced+recovery+after+surgery+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharm%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols.</a> Front Pharm. 11, 583422(2020).</li>
<li>Stoffels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+involves+interleukin-1+receptor+signaling+in+enteric+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia.</a> Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Yu, Y. B., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+and+their+role+in+the+intestinal+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier.</a> World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).</li>
<li>Savidge, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia+regulate+intestinal+barrier+function+and+inflammation+via+release+of+S-nitrosoglutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).</li>
<li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).</li>
<li>Hellman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+equine+enteroids+and+enteroid-derived+2D+monolayers+that+are+responsive+to+microbial+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics.</a> Vet Res. 52 (1), 108(2021).</li>
<li>Al-Sadi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+modulation+of+intestinal+epithelial+tight+junction+permeability+is+mediated+by+JNK+pathway+activation+of+claudin-2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene.</a> PLoS One. 9 (3), e85345(2014).</li>
<li>Ochoa-Cortes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells%3A+A+new+frontier+in+neurogastroenterology+and+clinical+target+for+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases.</a> Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).</li>
<li>Ziegler, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cell+network+function+is+required+for+epithelial+barrier+restitution+following+intestinal+ischemic+injury+in+the+early+postnatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).</li>
<li>Grubišić, V., Gulbransen, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia%3A+the+most+alimentary+of+all+glia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enteric glia: the most alimentary of all glia.</a> J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>buffer Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>10 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>2 mM GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>25050-061</td><td></td></tr><tr><td>4' 6-Diaminidino-2-Phénylindol</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps d’actine du muscle lisse alpha</td><td>Abcam</td><td>7817</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>Sigma</td><td>AA9529</td><td>4,4 g/mL aliquotes de base, concentration finale 1,1 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Antimicotique 1x</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>AA3311</td><td></td></tr><tr><td>BSA 50 mg/mL solution mère</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CaCL2</td><td>ACROS Organiics</td><td>206791000</td><td>Composante de Equine Ringer ' s Stock 1 : mélanger avec d’autres ingrédients, puis ajouter 100 ml de ce bouillon dans un cylindre gradué et diluer à 1L avec de l’eau déminéralisée. Ajustez le pH à 7,4 avec 5 % de CO2, Combinez avec Equine Ringer' s Stock 2 pour compléter " Sonnerie ».</td></tr><tr><td>Collagénase</td><td>Sigma</td><td>9891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 média</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-lapin IgG Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>21207</td><td></td></tr><tr><td>EVOM EndOhm double électrode chambre de mesure TEER</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVM-EL-03-01</td><td></td></tr><tr><td>EVOM Manual for TEER Measurement</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVM-MT-03-01</td><td></td></tr><tr><td>G5</td><td>Gibco</td><td>17503012</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine solution</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td>Concentration finale 20 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Anticorps GFAP</td><td>Abcam</td><td>4674</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>28175</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&beta ; ELISA</td><td>Thermo Fisher</td><td>ESIL1B</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>P330-500</td><td>Composant de Equine Ringer' s Stock 1 : mélanger avec d’autres ingrédients, puis ajouter 100 ml de ce bouillon dans un cylindre gradué et diluer à 1L avec de l’eau déminéralisée. Ajustez le pH à 7,4 avec 5 % de CO2, Combinez avec Equine Ringer' s Stock 2 pour compléter " Sonnerie ».</td></tr><tr><td>L-glutamine solution</td><td>Corning</td><td>25-00-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>M33-500</td><td>Composant de Equine Ringer' s Stock 1 : mélanger avec d’autres ingrédients, puis ajouter 100 ml de ce bouillon dans un cylindre gradué et diluer à 1L avec de l’eau déminéralisée. Ajustez le pH à 7,4 avec 5 % de CO2, Combinez avec Equine Ringer' s Stock 2 pour compléter " Sonnerie ».</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP332-1</td><td>Composant de Equine Ringer' s Stock 2 : mélanger avec d’autres ingrédients, puis ajouter 100 ml de ce bouillon dans un cylindre gradué et diluer à 1L avec de l’eau déminéralisée. Ajustez le pH à 7,4 avec 5 % de CO2, Combinez avec Equine Ringer' s Stock 1 pour compléter " Sonnerie ».</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-10</td><td>Composant de Equine Ringer' s Stock 1 : mélanger avec d’autres ingrédients, puis ajouter 100 ml de ce bouillon dans un cylindre gradué et diluer à 1L avec de l’eau déminéralisée. Ajustez le pH à 7,4 avec 5 % de CO2, Combinez avec Equine Ringer' s Stock 2 pour compléter " Sonnerie ».</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP329-500</td><td>Composant de la Sonnerie équine' s Stock 2 : mélanger avec d’autres ingrédients, puis ajouter 100 ml de ce bouillon dans un cylindre gradué et diluer à 1L avec de l’eau déminéralisée. Ajustez le pH à 7,4 avec 5 % de CO2, Combinez avec Equine Ringer' s Stock 1 pour compléter " Sonnerie ».</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher</td><td>S637-212</td><td>Composant de Equine Ringer' s Stock 2 : mélanger avec d’autres ingrédients, puis ajouter 100 ml de ce bouillon dans un cylindre gradué et diluer à 1L avec de l’eau déminéralisée. Ajustez le pH à 7,4 avec 5 % de CO2, Combinez avec Equine Ringer' s Stock 1 pour compléter " Sonnerie ».</td></tr><tr><td>Solution stylo/streptocoque</td><td>Gemini</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td>0,5 mg/mL dans 1x tampon de borate</td></tr><tr><td>Logiciel Prism GraphPad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protéase</td><td>Sigma</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bicarbonate</td><td>de sodium Sigma</td><td>S8761</td><td>Solution mère à 7,5 %</td></tr></tbody></table>

culture gliale entérique équine et application à l’étude d’un mécanisme inflammatoire neuronal dans les coliques équines

Equine Enteric Glial Culture and Application to the Study of a Neural Inflammatory Mechanism in Equine Colic

La microdissection du jéjunum équin à la couche sous-muqueuse (Figure 1) avec une digestion enzymatique et mécanique supplémentaire, pourrait produire des cultures cellulaires viables de glie entérique équine. Les cellules ont montré un pléomorphisme avec une dominance de cellules en forme de fuseau compatible avec la glie entérique d’autres espèces (Figure 2A). Les cultures étaient positives pour le marqueur glial sélectif, la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), avec une faible contamination par les fibroblastes (alpha SMA, Figure 2B). Dans certains cas, la microdissection des couches sous-muqueuses n’a pas été contrôlée à un degré suffisamment élevé, et les cultures ont été contaminées par des pourcentages élevés de fibroblastes observés par immunofluorescence du marqueur des fibroblastes, l’actine musculaire lisse (Figure 3).
Ensuite, à titre d’exemple de l’utilité de la culture gliale entérique équine, l’impact de la glie entérique exposée à l’IL-1β sur la fonction de la barrière épithéliale intestinale a été évalué. L’exposition basolatérale à des milieux provenant d’une culture gliale entérique sous-muqueuse équine exposée à 10 ng et 25 ng d’IL-1β pendant 24 h a significativement augmenté la perméabilité (p = 0,05 et 0,04, respectivement, moyenne des milieux témoins = 0,9, moyenne gliale 10 ng IL-1β groupe = 0,8, intervalle de confiance à 95 % = -0,2 à 0,02, moyenne gliale 25 ng IL-1β groupe = 0,8, Intervalle de confiance à 95 % = -0,1995 à 0,01060, n = 3-4) (figure 4A). Cependant, l’exposition des monocouches épithéliales équines à l’IL-6 équine basolatérale 10-25 ng, une cytokine inflammatoire dont il a été démontré qu’elle était produite à la fois par la glie entérique exposée à l’IL-1β et qu’elle induisait une perméabilité accrue des entérocytes dans les modèles de rongeurs12, n’a pas augmenté de manière significative la perméabilité des monocouches d’entérocytes équins (Figure 4B)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig01.jpg"> Figure 1 : Isolement de la glie entérique du jéjunum équin par microdissection et digestion enzymatique et mécanique. (A) Le jéjunum a été coupé le long du bord antitimesenérique et épinglé côté muqueuse vers le haut. (B) Les villosités intestinales ont été visualisées par microscopie et retirées avec un léger grattage jusqu’à ce que la lamina propria vaporeuse soit visualisée. (C) La couche de lamina propria a ensuite été retirée jusqu’à ce que les fibres musculaires lisses soient à peine visibles à travers la sous-muqueuse translucide. (D) La sous-muqueuse a été tentée et retirée de la couche musculaire, faisant des coupures sur des étiquettes fibreuses au besoin. Les images ont été obtenues par un microscope de dissection 10x (B,C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig02.jpg"> Figure 2 : Imagerie des cultures de glie entérique sous-muqueuse équine. (A) La morphologie étoilée (flèches), fusiforme (pointe de flèche ouverte) et ganglionnaire (pointe de flèche fermée) de la glie entérique équine a été appréciée par microscopie à contraste de phase. (B) La pureté des cultures a été évaluée par coloration pour le GFAP, et pour le marqueur fibroblaste, l’actine des muscles lisses Barres d’échelle = 100 mm (A), 400 mm (B). Abréviations : GFAP = protéine acide fibrillaire gliale ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig03.jpg"> Figure 3 : Imagerie de cultures de cellules gliales entériques sous-muqueuses équines infructueuses. La pureté des cultures a été évaluée par coloration pour le GFAP (rouge), et pour le marqueur des fibroblastes, l’actine musculaire lisse (vert), démontrant un pourcentage élevé de contamination par les fibroblastes. La pointe de flèche jaune indique la GFAP et la pointe de flèche blanche l’actine musculaire lisse. Barre d’échelle = 400 mm. Abréviation : GFAP = protéine acide fibrillaire gliale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig04.jpg"> Figure 4 : Monocouche épithéliale équine TEER suite à une exposition à des cytokines inflammatoires et à des produits gliaux inflammatoires. (A) L’exposition basolatérale à des milieux issus d’une culture de cellules gliales entrices sous-muqueuses équines, exposée à 10 ng et 25 ng d’IL-1β pendant 24 h, a significativement augmenté la perméabilité (*p = 0,05 et 0,04, respectivement, n = 3-4). (B) L’exposition aiguë d’entérocytes équins monocouches à 25 ng d’IL-1β basolatéraux et à 10-25 ng d’IL-6 équine n’a pas augmenté de manière significative la perméabilité de la monocouche épithéliale équine (n = 2-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Réactifs pour l’isolement et la culture. Les réactifs suivants ont été utilisés pour formuler des milieux pour l’isolement de la glie entérique équine, la culture gliale entérique et la culture de cellules souches épithéliales intestinales équines. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244_Table%201_rev.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Culture gliale entérique équine et application à l’étude d’un mécanisme inflammatoire neuronal dans les coliques équines

Inflammatory postoperative conditions of equine colic (acute abdomen) contribute not only to increased client cost, patient discomfort, and ...

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