Co-culture de cellules épithéliales, mésenchymateuses, endothéliales et immunitaires dérivées d’iPSC pour modéliser l’intégrité de la barrière des voies respiratoires dans la santé et les maladies pulmonaires

Mes recherches portent sur la compréhension du remodelage des voies respiratoires humaines. Les voies respiratoires humaines servent de barrière contre les toxines environnementales, notamment les virus, la pollution de l’air et la fumée de tabac. Ces toxines peuvent endommager les voies respiratoires, les faire changer ou se remodeler, ce qui rend la respiration difficile.

Le système modèle comprend non seulement les cellules épithéliales qui forment la barrière, mais aussi d’autres cellules importantes dans l’homéostasie des voies respiratoires, y compris les cellules des vaisseaux sanguins et les cellules immunitaires appelées macrophages. Les défis expérimentaux actuels comprennent la modélisation du poumon humain dans un système modèle in vitro. Il est difficile d’obtenir des échantillons primaires de poumons et ils sont également très difficiles à cultiver.

Ainsi, l’utilisation de cellules pulmonaires dérivées de cellules souches investies de cellules endothéliales et de macrophages est la prochaine étape pour surmonter ces défis. Pour commencer, enduire la face apicale des inserts de culture cellulaire en polyester à pores de 3 micromètres avec 4 milligrammes par millilitre de solution de matrice extracellulaire, ou ECM. Pipetez la solution ECM résiduelle.

Placez ensuite l’assiette dans l’incubateur pendant 1 heure à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une pince à épiler propre, transférez stérilement les inserts de culture cellulaire de la plaque à 12 puits dans une grande boîte de Pétri. Ensuite, enduire le côté basolatéral des inserts de culture cellulaire avec une solution ECM.

Après avoir pipeté la solution résiduelle d’ECM, placez la boîte de Pétri dans un incubateur à 37 degrés Celsius pour qu’elle sèche pendant la nuit. Laver le ballon T75 contenant des cellules endothéliales dérivées d’iPSC avec du PBS. Après avoir aspiré la solution, ajoutez 5 millilitres de protéase de type trypsine dans le ballon et incubez à 37 degrés Celsius pendant 8 minutes.

Tapotez le ballon pour vous assurer que les cellules endothéliales se détachent. Transférez ensuite les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Ajouter 5 millilitres de milieu d’arrêt pour arrêter la dissociation.

Ensuite, centrifugez les cellules à 300 G pendant 5 minutes. Une fois le surnageant aspiré, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 millilitre de milieu de culture endothéliale contenant 10 micromolaires d’inhibiteur de ROCK. Après avoir aliquoté 150 000 cellules, suspendez-les à nouveau dans 100 microlitres de milieu et pipetez sur l’insert de culture cellulaire inversé avec le côté basolatéral vers le haut.

Transférez soigneusement les cellules dans l’incubateur et laissez-les tranquilles pendant 3 heures. Ensuite, dans une plaque à 12 puits, ajoutez 1 millilitre de milieu de culture endothéliale dans chaque puits. Retirez la boîte de Pétri contenant les cellules endothéliales de l’incubateur.

À l’aide d’une pince à épiler propre, transférez soigneusement les inserts de culture cellulaire dans la plaque avec un milieu de culture endothéliale. Après avoir vérifié visuellement que les cellules endothéliales ont adhéré, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir isolé les organoïdes du polymère ECM et les avoir trypsinisés pendant 15 à 20 minutes, ajoutez 3 millilitres de milieu d’arrêt pour arrêter la réaction de protéase.

Remettre la solution en suspension à l’aide d’une pipette P1000 et centrifuger à 400 G pendant 5 minutes. Ensuite, aspirez le surnageant des organoïdes des voies respiratoires et remettez les organoïdes en suspension dans 1 millilitre de milieu d’expansion des voies respiratoires avec 10 micromolaires d’inhibiteur de ROCK. Prélever un échantillon de 10 microlitres pour un hémocytomètre et placer les cellules restantes sur de la glace pendant le comptage.

Ensuite, ensemencez 300 000 cellules des voies respiratoires dérivées d’iPSC dans 500 microlitres de milieu d’expansion des voies respiratoires par insert de culture cellulaire de 12 millimètres. Retirez la plaque avec les inserts de culture cellulaire contenant des cellules endothéliales de l’incubateur à 37 degrés Celsius. Mettez à nouveau en suspension les cellules des voies respiratoires iPSC et pipetez 500 microlitres contenant 300 000 cellules dans la chambre apicale de chaque insert de culture cellulaire.

Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 48 heures, en maintenant les cellules apicales dans des conditions liquide-liquide. Après l’incubation, retirer le milieu du côté apical de l’insert de culture cellulaire. Remplacer le milieu basolatéral par un mélange 1:1 de milieux de différenciation des voies respiratoires et de milieux de culture endothéliale.

Remettez la plaque dans l’incubateur. Dissociez les macrophages dérivés d’iPSC du ballon à l’aide d’un racleur cellulaire. Centrifuger à 300 G pendant 5 minutes.

Après cela, aspirez le surnageant. Ensuite, réinstallez les macrophages iPSC en suspension dans 1 millilitre de milieu MAC-CM2. Prélever un échantillon de 10 microlitres pour le comptage des cellules et placer les cellules restantes sur de la glace pendant le comptage.

Après le comptage, transférez 300 000 macrophages dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Centrifugez le tube à 200 G pendant 5 minutes. Après la centrifugation, pipeter le surnageant du tube.

Retirez de l’incubateur les inserts contenant des co-cultures de cellules endothéliales et des voies respiratoires. Ensemencez 300 000 macrophages dans 35 microlitres de MAC-CM2 sur la face apicale de l’insert de culture cellulaire.