Réalisation d’un criblage CRISPR in vitro à l’échelle du génome dans des cellules T à récepteur d’antigène chimérique

La thérapie par cellules CAR-T est un type innovant d’immunothérapie du cancer qui a conduit à des rémissions qui ont duré plus d’une décennie. Cependant, les taux de réponses durables sont encore limités. Avec ce protocole, nous visons à améliorer notre compréhension des mécanismes à l’origine de la résistance et à créer des outils pour améliorer la réponse à la thérapie cellulaire CAR-T.

De nombreuses approches sont actuellement utilisées pour améliorer la thérapie cellulaire CAR-T, y compris les thérapies combinées et l’optimisation de la conception des CAR. Cependant, en raison des preuves de plus en plus nombreuses que le profil épigénétique des produits à base de cellules CAR-T avant la perfusion est une réponse déterminante importante, les technologies d’édition génétique sont devenues des outils populaires.

L’édition génomique des cellules CAR-T a montré son succès dans la prévention des toxicités et l’augmentation de l’expansion et de la persistance des cellules CAR-T dans les études précliniques et cliniques. Notre protocole de dépistage CRISPR à l’échelle du génome offre une approche efficace et impartiale pour déterminer les meilleures modifications génétiques afin d’améliorer la fonction des cellules CAR-T.

Les perturbations génétiques à l’échelle du génome nécessitent des conditions de sélection adéquates et à grande échelle pour être efficaces. Pour étudier le développement de l’épuisement des cellules CAR-T, nous avons appris que nous devons stimuler plus de 80 millions de cellules CAR-T pendant deux semaines pour sélectionner les modifications génétiques optimales.

Bien que notre protocole ait été conçu pour évaluer le développement de l’épuisement, ce protocole peut être ajusté pour évaluer le développement d’autres mécanismes de résistance. En réalisant des criblages à l’échelle du génome dans différents contextes, nous pourrions éventuellement déterminer les meilleures modifications pour améliorer les réponses globales à la thérapie cellulaire CAR-T.

[Narrateur] Après avoir transduit les cellules CAR-T avec la bibliothèque CRISPR, centrifugez les échantillons à 300 g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius pour les laver. Aspirez le surnageant et remettez les échantillons en suspension dans 20 millilitres de milieu de cellules T. Pour préserver les échantillons en vue du séquençage de nouvelle génération, aliquotez suffisamment de cellules CAR-T dans un tube conique de 50 millilitres pour maintenir une représentation de l’ARN guide de 500 cellules par ARN guide. Centrifugez l’échantillon à 300 g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, mettez en suspension la pastille de cellule dans un millilitre de PBS et transférez-la dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres. Lavez le tube conique de 50 millilitres avec un millilitre de PBS et transférez le lavage dans le même tube de microcentrifugation. Ensuite, centrifugez les échantillons à 500 g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius. Retirez le surnageant et conservez les pastilles de cellules à -20 degrés Celsius. Pour commencer la co-culture, ajoutez des cellules CAR-T aux cellules JeKo-1 CD19 positives dans un rapport de un pour un. Portez le volume total de la co-culture à 160 millilitres avec un milieu à cellules T et stockez les échantillons dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Pour stimuler à nouveau les cellules CAR-T, collectez les co-cultures dans des tubes coniques de 50 millilitres et centrifugez les échantillons à 300 g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius. Remettez chaque échantillon en suspension dans 80 millilitres de milieu de cellules T et ajoutez-en 80 fois 10 à la puissance de six cellules JeKo-1 dans 80 millilitres de milieu de cellules T. Conservez les échantillons dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le 15e jour, pour isoler les cellules CAR-T de la co-culture, comptez d’abord les cellules. Combinez un kit de sélection positive pour les lymphocytes T CD4 positifs avec un kit de sélection positive pour les lymphocytes T CD8 positifs afin d’isoler les lymphocytes T des co-cultures CAR T JeKo-1. Comptez ensuite les lymphocytes T isolés. Pour préserver les échantillons pour le séquençage de nouvelle génération, aliquote 33 fois 10 à la puissance de six cellules CAR-T dans un tube conique de 50 millilitres et centrifuger l’échantillon à 300 g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius. Remettez la pastille cellulaire en suspension dans un millilitre de PBS et transférez-la dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres. Ensuite, lavez le tube conique de 50 millilitres avec un millilitre de PBS et transférez le lavage dans le même tube de microcentrifugation. Après avoir centrifugé les échantillons et retiré le surnageant, stockez les pastilles de cellule à -20 degrés Celsius. Pour commencer, isolez l’ADN génomique de pastilles de cellules CAR-T congelées à l’aide d’un kit d’isolement d’ADN génomique. Purifiez l’ADN génomique isolé par précipitation d’éthanol en pré-refroidissant d’abord l’éthanol à 100 % à -20 degrés Celsius. Aliquote l’ADN élué de manière égale dans plusieurs tubes de microcentrifugation, en veillant à ce que chaque aliquote soit de 200 à 250 microlitres. Ajoutez deux volumes d’éthanol à 100 % pré-réfrigéré, 0,1 volume d’acétate de sodium à trois molaires et un microlitre de glycogène de 20 milligrammes par millilitre. Incuber les échantillons pendant la nuit à -20 degrés Celsius. Le deuxième jour, faites tourner les échantillons à 13 000 g pendant 20 minutes pour granuler l’ADN précipité. Retirez le surnageant et lavez les granulés avec un millilitre d’éthanol à 70 % en les faisant tourner à 7 500 g pendant 10 minutes. Après avoir complètement séché les granulés, remettez les granulés en suspension dans 50 microlitres d’eau stérile. Pour préparer l’ADN génomique pour le séquençage de nouvelle génération, configurez une PCR avec le mélange réactionnel spécifié illustré ici. Effectuez ensuite la PCR en utilisant les conditions de cycle suivantes. Extrayez les réactions PCR de chaque échantillon et purifiez le produit PCR à l’aide d’un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Analysez trois microgrammes du produit PCR pour chaque échantillon sur un gel d’agarose à 2 %. Retirez le produit PCR du gel en extrayant l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction de gel selon les instructions du fabricant. Conservez les échantillons extraits à -20 degrés Celsius.