Name: Analyse par microscopie confocale du tri des protéines vers les plasmodesmes chez Nicotiana benthamiana (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Découvrez l'analyse par microscopie confocale du ciblage des protéines vers les plasmodesmes chez Nicotiana benthamiana. Cette méthode permet de visualiser la localisation de PDLP5, TVCV MP et PDCB1 pour étudier les mécanismes de transport cellulaire.

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<meta charset="utf8"></head><body>Exploration de la fonction des plasmodesmes : microscopie confocale de protéines ciblées

<ol><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-localized+protein+mediates+crosstalk+between+cell-to-cell+communication+and+innate+immunity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).</li>
<li>Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+gateways+to+local+and+systemic+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).</li>
<li>Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Channels+under+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Channels under pressure.</a> Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).</li>
<li>Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Structure%2C+function+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).</li>
<li>Fernandez-Calvino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasmodesmal+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasmodesmal proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18880(2011).</li>
<li>Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+meta-proteomic+pipeline+for+the+identification+of+plasmodesmata+proteins+and+regulatory+conditions+in+diverse+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species.</a> BMC Biol. 20, 128(2022).</li>
<li>Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-associated+%CE%B2-1%2C3-glucanase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis.</a> The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).</li>
<li>Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+rice+membrane+dynamics+and+plasmodesmata+during+biotrophic+invasion+by+the+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus.</a> The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).</li>
<li>Aung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+target+plant+plasmodesmata+to+colonize+and+invade+surrounding+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues.</a> The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).</li>
<li>Cui, W., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+callose+synthases+CalS1%2F8+regulate+plasmodesmal+permeability+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress.</a> Nat Plants. 2 (5), 160(2016).</li>
<li>Liu, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytosphinganine+affects+plasmodesmata+permeability+via+facilitating+PDLP5-stimulated+callose+accumulation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis.</a> Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).</li>
<li>Caillaud, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+protein+PDLP1+localizes+to+haustoria-associated+membranes+during+downy+mildew+infection+and+regulates+callose+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition.</a> PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).</li>
<li>Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Z+%22The+Plant+Cell%22">The Plant Cell</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+X+%22Sci+Bull%22">Sci Bull</a>. , (2024).</li>
<li>Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+GPI-anchor+plasmodesmal+neck+protein+with+callose+binding+activity+and+potential+to+regulate+cell-to-cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking.</a> The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).</li>
<li>Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+targeting+of+a+plasmodesmal+protein+affecting+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication.</a> PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).</li>
<li>Lim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+localizing+proteins+regulate+transport+and+signaling+during+systemic+acquired+immunity+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).</li>
<li>Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+several+Nicotiana+species+as+hosts+for+high-scale+Agrobacterium-mediated+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression.</a> Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).</li>
<li>Walhout, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+recombinational+cloning%3A+Application+to+the+cloning+of+large+numbers+of+open+reading+frames+or+ORFeomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes.</a> Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsRNA-induced+immunity+targets+plasmodesmata+and+is+suppressed+by+viral+movement+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins.</a> The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).</li>
<li>Roberts, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+frequency+and+architecture+of+plasmodesmata+during+the+sink-source+transition+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves.</a> Protoplasma. 218, 31-44 (2001).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+localization+signal+of+TMV+MP+is+recognized+by+plant+synaptotagmin+SYTA%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA.</a> mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).</li>
<li>Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+prevents+the+development+of+cold+and+mechanical+allodynia+in+paclitaxel-treated+female+C57Bl6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice.</a> Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).</li>
<li>Erkkilä, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widefield+fluorescence+lifetime+imaging+of+protoporphyrin+IX+for+fluorescence-guided+neurosurgery%3A+An+ex+vivo+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study.</a> J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).</li>
<li>Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobamovirus+Turnip+vein+clearing+virus+30-kilodalton+movement+protein+localizes+to+novel+nuclear+filaments+to+enhance+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection.</a> J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+plasmodesmal+localization+signal+in+a+plant+viral+cell-to-cell-movement+protein%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein.</a> mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).</li>
<li>Kumar, G., Dasgupta, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability%2C+functions+and+interactions+of+plant+virus+movement+proteins%3A+what+do+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far.</a> Microorganisms. 9 (4), 695(2021).</li>
<li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+nondestructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses.</a> Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Moteur ABT AC 1 phase</td><td>BRANDTECH&</td><td>nbsp ; ABF63/4C-7RQ</td><td></td></tr><<tr><td>em>Agrobacterium tumefaciens EHA105</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contrôle de la contamination&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td>CCI</tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Mélange d’enzymes</td><td>Invitrogen</td><td>#11789020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Mélange d’enzymes</td><td>Invitrogen</td><td>#11791020</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.1.</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td> National <td>Institutes of Health et le Laboratoire d’instrumentation</td><td></td><td></td>optique et computationnelle</tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM 900</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Espèces</td><td></td><td></td>végétales</tr><tr><td>pDONR207</td><td>Invitrogen</td><td>#12213013</td><td></td></tr><tr><td>Q5 ADN polymérase haute fidélité</td><td>ONÉ</td><td>#M0491S</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse par microscopie confocale du tri des protéines vers les plasmodesmes chez nicotiana benthamiana

Confocal Microscopy Analysis of Protein Sorting to Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Pour faciliter l’étude de la fonction de la DP dans la physiologie végétale et des interactions avec les agents pathogènes, trois protéines de référence simples et fiables ont été développées pour la localisation de la DP. Deux protéines cellulaires et une protéine MP dérivée d’un agent pathogène codées par le TVCV du tobamovirus végétal ont été sélectionnées. La localisation subcellulaire de ces protéines a été visualisée à l’aide d’un rapporteur autofluorescent EGFP fusionné à l’extrémité C-terminale de chaque protéine. Dans une approche alternative, les DP ont été visualisées à l’aide de la coloration au bleu d’aniline des dépôts de callose associés à la DP. Les expériences ont montré que PDLP5 et MP présentaient tous deux une localisation ponctuée de la, la MP étant également localisée dans le noyau cellulaire (Figure 1A), comme indiqué précédemment25. En revanche, PDCB1 semblait se répartir entre et RE (Figure 1A). Pour les chercheurs moins expérimentés dans l’interprétation de la localisation subcellulaire des protéines marquées à la GFP, la figure 1A illustre également le profil nucléocytoplasmique caractéristique de l’EGFP exprimé dans les cellules végétales. Pour confirmer le signal RE de PDCB1, nous avons co-exprimé PDCB1 avec un marqueur RE et avons constaté que le signal PDCB1 chevauchait le signal du marqueur RE (Figure 1B). Pour évaluer l’efficacité de la localisation des protéines testées, le pourcentage de cellules exprimant le signal fluorescent qui présentaient une localisation de ce signal a été calculé (Tableau 1).
Pour l’identification de la localisation subcellulaire à l’aide de protéines de référence, il est utile de comprendre l’échelle de temps de l’expression de la protéine de référence et les changements potentiels de sa localisation. La figure 2 montre une telle cinétique pour MP, PDLP5 et PDCB1 lorsque les eux-mêmes ont été visualisés par coloration au bleu d’aniline. MP et PDLP5 ont commencé à s’accumuler au niveau de la déjà un jour après l’infiltration (dpi), et cette accumulation a atteint un maximum apparent à 2 dpi, restant stable pendant 5 jours supplémentaires, après quoi l’intensité du signal a diminué, très probablement en raison de la dégradation des protéines. L’évolution temporelle du tri subcellulaire de PDCB1 était plus complexe : pour les premiers 3 dpi, PDCB1 présentait un signal RE comparativement fort, qui obscurcissait presque complètement la localisation du signal spécifique de, tandis qu’à 5 dpi, ce dernier signal devenait plus prononcé (Figure 2), bien que dans moins de cellules. Il est intéressant de noter que l’émergence du modèle de localisation clair de PDCB1 après 5 dpi a coïncidé avec beaucoup moins de cellules montrant le signal EGFP (Figure supplémentaire 1). Ainsi, PDLP5 et MP peuvent fonctionner comme des protéines de référence avec peu de bruit de fond dans la plupart des autres compartiments cellulaires, avec une fenêtre de temps de visualisation optimale de 2 à 5 dpi. PDCB1, en revanche, n’est pas aussi approprié qu’un marqueur.
Il a ensuite été vérifié que les marqueurs de la conservent leur spécificité de localisation subcellulaire en présence d’autres protéines de la. À cette fin, MP-EGFP ou PDLP5-EGFP a été co-exprimé avec un-localisant 26 MP d’un autre virus végétal, le virus de la mosaïque du tabac (TMV) marqué avec CFP. La figure 3 montre que, dans les deux cas, les protéines co-exprimées présentaient un schéma clair de localisation de la. De même, la coloration histologique au bleu d’aniline spécifique à la des tissus exprimant MP-EGFP ou PDLP5-EGFP n’a détecté aucune interférence avec la localisation des signaux EGFP et bleu d’aniline (Figure 3).
Les études de localisation de la bénéficient souvent d’une estimation plus quantitative de l’expression globale de la protéine de référence et du signal de la. Cette approche de quantification est illustrée à la figure 4 et à la figure 5. Pour la quantification de l’expression générale, l’intensité du signal de PDLP5 et MP a été mesurée. Les deux protéines ont montré des signaux forts à tous les points temporels de visualisation pendant la période de 10 dpi, avec une intensité de signal maximale à 3 dpi pour PDLP5 et à 2 dpi pour MP (Figure 4). Il n’y avait aucune différence statistiquement significative dans l’intensité du signal entre PDLP5 et MP à aucun des points temporels de visualisation. L’intensité du signal PDCB1 a montré une plus grande fluctuation entre les points temporels, le signal le plus fort étant observé à 7 ppp (figure 4), bien qu’il ait été difficile de recueillir des données statistiquement significatives à ce moment-là en raison de la rareté des cellules exprimées. Ainsi, les 3 premiers dpi représentent le moment optimal pour détecter l’expression de PDCB1. Comme prévu, les échantillons de coloration au bleu d’aniline ont montré un signal plus stable que les protéines exprimées transitoirement (Figure 4).
Les puncta formés par PDLP5 et MP ont ensuite été quantifiés. PDLP5 a montré un nombre stable de points tout au long de la période d’observation, sans différences statistiquement significatives entre deux des points temporels testés (figure 5). Le plus grand nombre de puncta formés par MP a été détecté à 2 dpi, et ils sont restés relativement stables jusqu’à la fin de la période d’observation. La comparaison du nombre de points entre PDLP5 et MP n’a révélé aucune différence statistiquement significative à la plupart des moments d’échantillonnage (figure 5). Le nombre de puncta teintés au bleu d’aniline est également resté stable, bien qu’il ait légèrement diminué à 10 dpi. Les nombres de puncta décorés de bleu d’aniline, de PDLP5 ou de MP étaient similaires les uns aux autres avec une signification statistique (figure 5), ce qui correspond à la spécificité DP de ces marqueurs. Le nombre de points pour PDCB1 n’a pas été analysé parce que, à des moments antérieurs, le signal était obscurci par le signal RE, et à des moments ultérieurs, il n’a été observé que dans un nombre relativement restreint de cellules (voir la figure 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig01.jpg"> Figure 1 : Localisation en plasmodesmes () de TVCV MP, PDLP5 et PDCB1 exprimée transitoirement dans Nicotiana benthamiana et coloration au bleu d’aniline de. (A) Localisation de MP-EGFP, PDLP5-EGFP et PDCB1-EGFP et coloration à l’aniline. Le signal EGFP est en vert, le signal bleu aniline est en bleu et l’autofluorescence plastide est en rouge. (B) Co-expression de MP-EGFP, PDLP5-EGFP et PDCB1-EGFP avec le marqueur du réticulum endoplasmique (RE) marqué par mRFP. Les images ont été enregistrées 2 jours après l’infiltration (dpi) et sont des coupes confocales simples représentatives de deux expériences indépendantes (N = 20 images de 2 plantes). Le signal EGFP est en vert, le signal mRFP est en violet et l’autofluorescence des plastes est en rouge. Les flèches jaunes indiquent que PDCB1 est localisé au RE. Barres d’échelle = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig02.jpg"> Figure 2 : Évolution temporelle de la localisation de la MP du TVCV MP, du PDLP5 et du PDCB1 exprimés transitoirement chez Nicotiana benthamiana et de la coloration au bleu d’aniline de la MP. Les images ont été enregistrées à 2 dpi et sont des coupes confocales uniques représentatives de deux expériences indépendantes (N = 20 images de 2 plantes pour tous les systèmes, sauf 7 dpi et 10 dpi pour PDCB1-EGFP, dans lesquels moins de cellules présentaient le signal). Le signal EGFP est en vert et le signal bleu aniline est en bleu. Barres d’échelle = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig03.jpg"> Figure 3 : TVCV MP et PDLP5 conservent leur localisation après co-expression avec un MP TMV localisant et co-coloration avec le bleu d’aniline. Les images ont été enregistrées à 2 dpi et sont des coupes confocales simples représentatives de N ≥ 10 images de 4 à 6 plantes. Le signal EGFP est en vert, le signal CFP et le signal bleu aniline sont en bleu et l’autofluorescence plastide est en rouge. Barres d’échelle = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig04.jpg"> Figure 4 : Évolution temporelle de l’intensité de fluorescence du TVCV MP, PDLP5 et PDCB1 exprimée transitoirement dans la coloration à Nicotiana benthamiana et au bleu d’aniline. Des données quantitatives ont été recueillies à partir des expériences décrites à la figure 2. Les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne de plusieurs expériences. Les points de données individuels sont indiqués comme moyenne pour chaque mesure. Les différences entre les valeurs moyennes évaluées par l’ANOVA à deux facteurs avec le test de comparaisons multiples de Tukey sont statistiquement significatives pour les valeurs P. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01 et ***P &lt; 0,001, ****P &lt; 0,0001 ; ns, non statistiquement significatif. Barres bleues, coloration à l’aniline ; barres vert clair, MP-EGFP, barres vert foncé, PDLP5-EGFP ; barres jaunes, PDCB1-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig05.jpg"> Figure 5 : Évolution temporelle de la formation de puncta par TVCV MP et PDLP5 exprimée transitoirement chez Nicotiana benthamiana et par coloration au bleu d’aniline de. Des données quantitatives ont été recueillies à partir des expériences décrites à la figure 2. Les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne de plusieurs expériences. Les points de données individuels sont indiqués comme moyenne pour chaque mesure. Les différences entre les valeurs moyennes évaluées par l’ANOVA à deux facteurs avec le test de comparaisons multiples de Tukey sont statistiquement significatives pour les valeurs P. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01, ***P &lt; 0,001, ****P &lt; 0,0001. Barres bleues, coloration à l’aniline ; barres vert clair, MP-EGFP, barres vert foncé, PDLP5-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="4">Expérience I</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Nombre total de cellules</td>
			<td>Cellules avec localisation de la MP</td>
			<td>Cellules à signal mixte</td>
			<td>Cellules avec localisation de la MP (%)</td>
		</tr><tr><td>Bleu aniline</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>3</td>
			<td>38</td>
			<td>7.5</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="4">Expérience II</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Nombre total de cellules</td>
			<td>Cellules avec localisation de la MP</td>
			<td>Cellules à signal mixte</td>
			<td>Cellules avec localisation de la MP (%)</td>
		</tr><tr><td>Bleu aniline</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>8</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>8</td>
			<td>97.5</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>31</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>2</td>
			<td>97.5</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Efficacité de la localisation de la DP.
Figure supplémentaire 1 : Localisation de TVCV MP, PDLP5 et PDCB1 exprimée transitoirement chez Nicotiana benthamiana. Les images ont été enregistrées à 5 dpi (A), 7 dpi (B) et 10 dpi (C). Le signal EGFP est vert et l’autofluorescence du plaste est rouge. Barres d’échelle = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/Figure%20S1.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Analyse par microscopie confocale du tri des protéines vers les plasmodesmes chez Nicotiana benthamiana

Plasmodesmata are membranous nanopores that connect the cytoplasm of adjacent plant cells and enable the cell-to-cell trafficking of nutrients, ...

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Biology

Biologie

Le trafic entre les cellules végétales macromoléculaire peut être évaluée par transitoirement exprimant une protéine fluorescente-marqués d'intérêt et d'analyser sa distribution intra-et intercellulaires par microscopie confocale.

Une cellule à cellule essai de transport macromoléculaire In planta Utilisant bombardement biolistique

Nous avons développé une technique pour tester les interactions entre protéines dans les plantes. Une protéine fluorescente jaune (YFP) est divisée en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d'un gène d'intérêt par l'intermédiaire du système de passerelle, permettant l'expression de protéines de fusion. Reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l'enquête.

Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système

Analyse cellulaire spécifique de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d'interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines.

Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Au niveau subcellulaire, les événements de signalisation sont modulés dynamiquement par des signaux développementaux et environnementaux. Nous décrivons ici un protocole qui utilise le système d’expression transitoire du tabac pour surveiller l’interaction dynamique protéine-protéine et pour révéler l’organisation spatiale de la transduction du signal dans les cellules végétales.

Imagerie réorganisation spatiale d&#39;une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d&#39;expression transitoire du tabac

Usine de connexions intercellulaires, les plasmodesmes (DP), jouent un rôle central dans l’usine des interactions plante-virus et physiologie. Critique de transport Pd sont tri signaux qui dirigent les protéines à Pd. Cependant, nos connaissances sur ces séquences est encore à ses balbutiements. Nous décrivons une stratégie visant à identifier les signaux de localisation de Pd dans les protéines ciblées Pd.

Identification de séquences de localisation Plasmodesmal en protéines In Planta

Cet article décrit une procédure expérimentale simple et rapide pour déterminer les interactions protéine-protéine basées sur la mesure de l’activité de la luciférase.

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Nous avons développé une nouvelle méthode pour exprimer conjointement plusieurs protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes à surmonter les difficultés des méthodes conventionnelles. Il prend avantage d’utiliser un plasmide d’expression unique qui contient plusieurs protéines fonctionnellement indépendant exprimant des cassettes pour atteindre la co-expression de protéine.

La co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes Fusion de façon efficace dans les plantes

Ce protocole présente comment vivre image et analyser les méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser.

Imagerie confocale direct des méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes

Décrit ici est une méthode d’étiquetage de proximité pour l’identification des partenaires d’interaction du domaine TIR du récepteur immunitaire NLR dans le tissu foliaire de Nicotiana benthamiana. Un protocole détaillé pour l’identification des interactions entre d’autres protéines d’intérêt utilisant cette technique à Nicotiana et d’autres espèces végétales est également fourni.

Étiquetage de proximité basé sur TurboID pour l’identification dans planta des réseaux d’interaction protéines-protéines

Les primordia des feuilles de maïs sont profondément gainées et roulées, ce qui les rend difficiles à étudier. Ici, nous présentons des méthodes de préparation de coupes transversales et de montures entières de primordia de feuilles de maïs pour la fluorescence et l’imagerie confocale.

Méthodes améliorées de préparation de sections transversales et de montures entières déroulées de primordia de feuilles de maïs pour la fluorescence et l’imagerie confocale

Découvrez l'analyse par microscopie confocale du ciblage des protéines vers les plasmodesmes chez Nicotiana benthamiana. Cette méthode permet de visualiser la localisation de PDLP5, TVCV MP et PDCB1 pour étudier les mécanismes de transport cellulaire.

Analyse par microscopie confocale du tri des protéines vers les plasmodesmes chez Nicotiana benthamiana

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