In vitro Modélisation de la neurogenèse trisomique à l’aide de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

La recherche à long terme vise à trouver des traitements potentiels pour les troubles neurologiques liés au syndrome de Down. Et nous nous concentrons actuellement sur la neurogenèse altérée du syndrome de Down, une cause majeure de déficience intellectuelle. Nous avons constaté que la neurogenèse altérée du syndrome de Down est causée par un défaut du cycle cellulaire biphasique, contrairement à la croyance populaire selon laquelle elle est uniquement due à la sénescence des cellules progénitrices neurales du syndrome de Down.

L’identification d’un défaut du cycle cellulaire biphasique à l’aide du protocole humain basé sur l’IPSC décrit dans ce manuscrit déterminera des stratégies thérapeutiques potentielles de développement, compte tenu à la fois de l’état du cycle cellulaire qui est une prolifération réduite au début de la phase et de l’échec de la sortie du cycle cellulaire à la phase tardive. Pour commencer, ajoutez 10 micromolaires d’inhibiteur de roche dans le milieu complet de l’iPCS humain, le DPBS, la solution de détachement cellulaire et le milieu conditionné par le nourrisseur complété par 25 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance des fibroblastes de base. Réchauffez tous les réactifs à 37 degrés Celsius.

Prenez une plaque à six puits d’iPSC sur les mangeoires. Pipetez les colonies différenciées et ajoutez un milieu iPSC humain complet frais. Placez l’assiette à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant deux heures.

Après l’incubation, lavez une fois les puits avec du DPBS sans calcium ni magnésium. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de décollement cellulaire dans chaque puits. Placez l’assiette à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant 12 à 14 minutes.

Observez les cellules au microscope inversé. Si la plupart des cellules se détachent, mais si certaines restent adhérentes, tapotez doucement la plaque sur les côtés. Ajoutez trois millilitres de DPBS complété par du calcium et du magnésium dans chaque puits pour diluer la solution de décollement cellulaire.

À l’aide d’une pipette de cinq millilitres, effectuez un pipetage doux deux à trois fois pour briser les grumeaux, tout en évitant les bulles. Passez les cellules à travers une crépine de 40 micromètres dans une centrifugeuse de 50 millilitres 2. Centrifugez la suspension à température ambiante pendant cinq minutes à 200 G.Utilisez un système d’aspiration sous vide pour aspirer doucement le fluide.

Maintenant, remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu iPSC humain. Transférez toutes les cellules en suspension dans une boîte de 15 centimètres recouverte de gélatine à 0,1 % et incubez dans un incubateur à dioxyde de carbone. Recueillir le milieu avec les cellules dans une centrifugeuse 2.

Centrifuger à température ambiante pendant cinq minutes à 200 G.Ensuite, aspirer doucement le média avec le système d’aspiration sous vide. Remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu conditionné à l’alimentation, complété par 25 nanogrammes par millilitre de BFGF et 10 micromolaires d’inhibiteur de roche. Après le comptage des cellules, préparez une suspension de 30 000 à 50 000 cellules par millilitre.

Grainez la suspension dans une assiette à puits. Après deux jours, remplacez le milieu conditionné à l’alimentation par une cellule progénitrice neurale, ou milieu NPC. Changez de support les jours deux et 18 comme indiqué.

Le jour 28, remplacez le milieu dans la plaque par un milieu NPC complété par 10 micromolaires d’inhibiteur de roche. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant deux heures. Après l’incubation, aspirez le surnageant et lavez les puits une fois avec du DPBS sans calcium ni magnésium.

Ajoutez un millilitre de solution de décollement cellulaire dans chaque puits. Observez ensuite les cellules sous un microscope inversé à un grossissement de 4x. Ensuite, pipetez trois millilitres de DPBS supplémenté en calcium et en magnésium dans chaque puits de la plaque.

À l’aide d’une pipette de cinq millilitres, pipetez doucement la suspension et cassez les grumeaux. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 micromètres placée sur une centrifugeuse de 50 millilitres 2. Centrifugez et aspirez comme démontré précédemment, puis remettez en suspension la pastille dans un millilitre de milieu de différenciation défini complété par B 27 et vitamine A. Comptez les cellules vivantes à l’aide du bleu de Trypan et d’un hémocytomètre.

Ensuite, ensemencez 50 000 cellules dans chaque puits d’une plaque de 48 puits qualifiée recouverte d’une matrice. Au jour 33, remplacez le milieu dans les puits de culture par un milieu de différenciation neurale. Une réduction significative des neurones TUBB3-positifs a été observée dans les cultures du syndrome de Down, par rapport aux cellules euploïdes isogéniques, avec une diminution d’environ deux fois évidente au jour 85.

Une proportion significativement plus faible de cellules positives à KI67 a été observée dans les cultures du syndrome de Down au stade neurogène précoce, par rapport aux cellules euploïdes isogéniques, montrant une réduction d’environ quatre fois. Au stade neurogène avancé, la plupart des cellules euploïdes isogéniques sont sorties du cycle cellulaire avec une coloration minimale de KI67, tandis que la majorité des cellules du syndrome de Down sont restées positives à KI67, montrant une multiplication par cinq. Une deuxième paire d’iPSC humaines euploïdes isogéniques du syndrome de Sown a confirmé une réduction des niveaux de neurones positifs à TUBB3 et une augmentation des cellules progénitrices neurales positives à PAX6 dans les cultures du syndrome de Down à la fin de la différenciation neurale, avec une réduction de deux fois des neurones positifs à TUBB3 et une augmentation de plus de deux fois des cellules positives à PAX6.