Name: Évaluation de la libération de LC3-II via les vésicules extracellulaires en relation avec l’accumulation de vésicules intracellulaires LC3-positives (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Découvrez comment évaluer la libération de LC3-II via les vésicules extracellulaires en lien avec l'accumulation de vésicules intracellulaires LC3-positives dans les cellules HeLa. Cette méthode permet d'étudier le rôle de l'autophagie dans la pathologie TDP-43.

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<meta charset="utf8"></head><body>Évaluation de la libération d’EV LC3-II-positive dans l’autophagie avec fusion des lysosomes altérée

<ol><li>Tanaka, Y., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+1+mutants+form+aggregates+that+induce+accumulation+of+prion-like+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43.</a> Prion. 10 (4), 283-289 (2016).</li>
<li>Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+era+of+cryptic+exons%3A+Implications+for+als-ftd%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">The era of cryptic exons: Implications for als-ftd.</a> Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).</li>
<li>Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+of+clinicopathological+heterogeneity+in+tdp-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy.</a> Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).</li>
<li>Chatterjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+extracellular+vesicle+tau+and+tdp-43+as+diagnostic+biomarkers+in+ftd+and+als%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als.</a> Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).</li>
<li>Kasai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+csf+nfl+and+csf+tdp-43+improves+diagnostic+performance+in+als%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als.</a> Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion+is+a+key+pathway+for+clearance+of+pathological+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43.</a> Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+als-ftd-csf+generates+tdp-43+aggregates+in+glioblastoma+cells+through+exosomes+and+tnts-like+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure.</a> Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Sasaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+spinal+cord+motor+neurons+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).</li>
<li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+mechanisms+in+als+and+ftd%3A+Disrupted+rna+and+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li>
<li>Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+common+pathway+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+involvement+of+lysosomal+dysfunction+in+pathological+changes+of+the+brain+in+aged+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+progranulin-driven+autophagy-lysosomal+pathway+mediates+secretion+of+the+nuclear+protein+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).</li>
<li>Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+secretion+via+extracellular+vesicles+is+regulated+by+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy+Rep%22%5BJournal%5D)">TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy.</a> Autophagy Rep. 3 (1), (2024).</li>
<li>Ratajczak, M., Ratajczak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microvesicles%2Fexosomes%3A+discovery%2C+disbelief%2C+acceptance%2C+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future.</a> Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).</li>
<li>Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abemaciclib+and+vacuolin-1+decrease+aggregate-prone+tdp-43+accumulation+by+accelerating+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux.</a> Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).</li>
<li>Dingjan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+and+phagosomal+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endosomal and phagosomal snares.</a> Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+regulates+lysosomal+function+and+biogenesis+through+acidification+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes.</a> Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).</li>
<li>Kanda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+freely+available+easy-to-use+software+%27EZR%27+for+medical+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics.</a> Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).</li>
<li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li>
<li>Plate, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+proteostasis+regulators+that+reprogram+the+ER+to+reduce+extracellular+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation.</a> eLife. 5, e15550(2016).</li>
<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mammalian+autophagy+in+protein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of mammalian autophagy in protein metabolism.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).</li>
<li>Nanayakkara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+lysosome+reformation+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic lysosome reformation in health and disease.</a> Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).</li>
<li>Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STX6-VTI1B-VAMP3+complex+facilitates+xenophagy+by+regulating+the+fusion+between+recycling+endosomes+and+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes.</a> Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsine EDTA</td><td>Fujifilm Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>Antenne parabolique 10 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 15 mL Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu ; L Pointe de pipette</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-301</td><td>pipetage</td></tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21417-52</td><td>un matériau pour solution tampon d’échantillon</td></tr><tr><td>3,3'-diaminobenzidine tétrachlorhydrate</td><td>Nacalai Tesque</td><td>11009-41</td><td>un matériau pour solution DAB</td></tr><tr><td>3,5 cm Plat&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Plat 6 cm&nbsp ;</td><td>TrueLine</td><td>TR4001</td><td></td></tr><tr><td>Bloc d’aluminium Bains thermostatiques (bains thermaux secs)</td><td>EYELA</td><td>273860</td><td></td></tr><tr><td>Aspirateur</td><td>SANSYO</td><td>SAP-102</td> solution <td>d’inhalation</td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycine A1</td><td>Adipogen</td><td>BVT-0252</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre conjuguée à la biotine Vecteur d’anticorps IgG anti-lapin</td><td> Laboratoires&nbsp ;</td><td>BA-1000</td><td>2ème anticorps pour l’immunobuvardage</td></tr><tr><td>Cheval conjugué à la biotine Anticorps IgG</td><td>Vector Laboratories&nbsp ;</td><td>BA-2000</td><td>2e anticorps pour l’immunobuvardage</td></tr><tr><td>Blocking One</td><td>Nacalai Tesque</td><td>03953-95</td><td>un matériau pour l’immunobuvard</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Nacalai Tesque</td><td>05808-61</td><td>un matériau pour solution tampon d’échantillon</td></tr><tr><td>Sérum de veau</td><td>cytiva</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>CanoScan LiDE 220</td><td>Scanner</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>CSLIDE220 CanonCentrifugeuse 5702 R</td><td>eppendolf</td><td>5703000039</td><td></td></tr><tr><td>Lames de comptage Double Chambre</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015J</td><td>comptage de cellules</td></tr><tr><td>Sonificateur numérique 450</td><td>BRANSON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>nacalai tasque</td><td>09659-14</td><td>véhicule</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-45</td><td>milieu de culture</td></tr><tr><td>DMEM sans rouge de phénol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08489-45</td><td>milieu de culture</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Dojindo&nbsp ;</td><td>348-01311</td><td>un matériau pour solution A68</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>version 16.16.27</td><td>analyse satistique</td></tr><tr><td>EZR</td><td>Référence n° 24</td><td>version 1.68</td><td>analyse satistique</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>173012</td><td>Milieu de culture</td></tr><tr><td>Fidji</td><td>NIH</td><td></td><td>Outil d’analyse d’image</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09886-05</td><td>un matériau pour solution tampon d’échantillon</td></tr><tr><td>Hoehst33342</td><td>Dojindo&nbsp ;</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Fujifilm Wako</td><td>080-0186</td><td>un matériau pour solution DAB</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA</td><td>62011</td><td>lingette nettoyante</td></tr><tr><td>Tube à faible rétention</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-MCT015CLB</td><td>transfection d’ARNi et d’ADN</td></tr><tr><td>LSM780 Microscope laser confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris monoclonale Anti-LC3 Anticorps</td><td>MBL</td><td>M186-3</td><td>1er anticorps pour immunobuvard</td></tr><tr><td>Chlorure de nickel(II) hexahydraté</td><td>Fujifilm Wako</td><td>149-01041</td><td>un matériau pour solution DAB</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine Sodium Salt</td><td>Nacalai Tesque</td><td>20117-12</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum réduit Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>transfection de siRNA et d’ADN</td></tr><tr><td>pEGFP-C1-hAtg13</td><td>Addgene</td><td>22875</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td>Milieu de culture</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kits</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-PCNA de lapin polyclonal</td><td>BioAcademia</td><td>70-080</td><td>1er anticorps pour immunobuvard</td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-syntaxine 6</td><td>Anticorps ProteinTech</td><td>10841-1-AP</td><td>1er anticorps pour immunobuvard</td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 Anticorps</td><td>ProteinTech</td><td>28283-1-AP</td><td>1er anticorps pour immunobuvard</td></tr><tr><td>Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 Anticorps</td><td>ProteinTech</td><td>20986-1-AP</td><td>1er anticorps pour immunobuvard</td></tr><tr><td>Difluorure de polyvinylidène Membrane</td><td>Milliore</td><td>IPVH00010</td><td>un matériau pour l’immunobuvardage</td></tr><tr><td>R</td><td>R development core team</td><td>version 4.4.1</td><td>analyse satistique</td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778</td><td>siRNA réactif de transfection</td></tr><tr><td>siRNA STX6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HSS115604</td><td>siRNA pour transfection</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-05</td><td>un matériau pour tampon Tris et solution A68</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Fujifilm Wako</td><td>192-13981</td><td>un matériau pour solution tampon d’échantillon</td></tr><tr><td>SPARK Lecteur de microplaques</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12935300</td><td>transfection de siRNA</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fujifilm Wako</td><td>193-00025</td><td>un matériau pour solution A68</td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé TC20 avec imprimante thermique</td><td>Bio-Rad</td><td>1450109J1</td><td>comptage de cellules</td></tr><tr><td>Thermobath</td><td>TOKYO RIKAKIKAI</td><td>MG-3100</td><td>incubation</td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>Réactif de transfection d’ADN</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR2300</td><td>réactif</td></tr> <tr><td>de transfection d’ADNTris(hydroxyméthyl)aminométhane</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-75</td><td>un matériau pour tampon Tris, tampon d’échantillon et solution A68</td></tr><tr><td>Trypan Blue Dye 0,40 %</td> <td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>comptage de cellules</td></tr><tr><td>Tube à couvercle ouvert ultra-transparent, 16 x 96 mm&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>361706</td><td>collecte pour la fraction P1 EV</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>collecte pour la fraction P2 EV</td></tr><tr><td>Vectastain ABC Standard Kit</td><td>Vector Laboratories&nbsp ;</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille de lavage</td> immunobuvard <td>comme une membrane</td> de <td>lavage</td> <td>1-4640-02</td></tr><tr><td>&mu ;-Slide 8 Bien élevé</td><td>ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de la libération de lc3-ii via les vésicules extracellulaires en relation avec l’accumulation de vésicules intracellulaires lc3-positives

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

Comme l’ont montré des études antérieures, le traitement par Baf a augmenté les niveaux de TSG101 (P1 : P &lt; 0,01, P2 : P = 0,012, tels que déterminés par l’ANOVA à deux facteurs dans EZR19) et LC3-II (P1 : P &lt; 0,01, P2 : P &lt; 0,01, tels que déterminés par l’ANOVA à deux facteurs dans EZR19) dans la fraction riche en VE. Notamment, le traitement Baf a également augmenté les niveaux de STX6 (P1 : P &lt; 0,01, P2 : P &lt; 0,01, tels que déterminés par l’ANOVA à deux facteurs dans EZR19) dans la fraction EV (Figure 1A), ce qui suggère que STX6 pourrait être un composant des VE. L’antigène nucléaire de cellule proliférante (PCNA) n’a pas été observé dans la fraction EV. L’immunotransfert de STX6 dans la fraction cellulaire a révélé que les niveaux de STX6 ont diminué de moitié avec son inactivation de siRNA (Figure 1B). L’inactivation de STX6 n’a pas affecté les niveaux de TSG101 dans les fractions de cellule et de VE dans des conditions traitées avec véhicule et avec Baf (Figure 1C). Cependant, l’inactivation de STX6 a augmenté les niveaux de LC3-II dans la fraction cellulaire sous la condition traitée par véhicule, mais pas dans la condition traitée par Baf. L’inactivation de STX6 a également augmenté les niveaux de LC3-II dans la fraction EV sous la condition traitée par Baf (Figure 1D). Ces résultats suggèrent que les méthodes utilisées pour détecter la LC3-II dans les VE par immunobuvardage sont suffisamment sensibles, même si l’efficacité de knockdown n’est pas substantielle. De plus, ces résultats indiquent que l’inactivation de STX6 augmente le nombre d’autophagosomes intracellulaires et améliore la libération extracellulaire des vésicules associées aux autophagosomes sous traitement Baf.
Pour déterminer plus en détail si l’inactivation de STX6 influence le nombre d’autophagosomes et d’autolysosomes intracellulaires, les autophagosomes et les lysosomes ont été visualisés à l’aide du marqueur d’autophagosome mCherry-LC3 et du marqueur de lysosome LAMP1-GFP. L’imagerie confocale de cellules vivantes a révélé des vésicules GFP et mCherry-positives dans les cellules HeLa exprimant LAMP1-GFP et mCherry-LC3 (Figure 2A). Les autolysosomes ont été identifiés comme des vésicules GFP et mCherry positives, tandis que les autophagosomes ont été identifiés comme des vésicules GFP négatives et mCherry-positive. L’inactivation de STX6 a augmenté le nombre d’autophagosomes et d’autolysosomes dans la condition traitée par véhicule (Figure 2B,C). Cependant, l’inactivation de STX6 n’a pas affecté le nombre d’autophagosomes et d’autolysosomes dans les conditions traitées par Baf (Figure 2B,C).
Pour déterminer si l’augmentation du nombre d’autophagosomes intracellulaires due à l’inactivation de STX6 résultait d’une formation accrue d’autophagosomes, la formation d’omégasomes, un processus requis pour la formation d’autophagosomes, a été examinée à l’aide de l’intensité du signal GFP-ATG13, marqueur omégasome. L’imagerie confocale de cellules vivantes a fourni une image assemblée de GFP-ATG13, indiquant la formation d’omégasomes (Figure 3A). L’inactivation de STX6 a diminué l’intensité du signal GFP-ATG13 (P = 0,023, déterminée par l’ANOVA à deux voies dans EZR19). Bien que l’inactivation de STX6 n’ait pas influencé de manière significative l’intensité du signal GFP-ATG13 dans des conditions traitées par un véhicule, elle a significativement diminué le signal dans des conditions traitées par Baf (Figure 3B). Collectivement, ces résultats indiquent que l’inactivation de STX6 augmente la libération de vésicules positives LC3-II liées à l’accumulation de vésicules associées aux autophagosomes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig01.jpg"> 
Figure 1 : Résultats de l’immunotransfert des fractions cellulaires, P1 et P2 des cellules HeLa transfectées avec un témoin ou un siRNA STX6 sous traitement par véhicule ou Baf. Les cellules HeLa ont été traitées avec un véhicule (DMSO) ou 100 nM Baf pendant 24 h après transfection avec un témoin ou un siRNA STX6. Les fractions cellulaires, P1 (20 000 × g de granules) et P2 (110 000 × g de granules) ont été isolées. (A) Images immunobuvantes représentatives de chaque fraction montrant STX6, TSG101, LC3 et PCNA. (B-D) Une analyse densitométrique pour (B) STX6, (C) TSG101 et (D) LC3-II a été effectuée à partir des images immunoblot. Les intensités du signal ont été normalisées en fonction du contrôle ou des cellules transfectées par le siRNA STX6 traitées avec un véhicule ou un Baf. Les graphiques à barres représentent les valeurs moyennes ± S.E.M. (N = 3). * indique P &lt; 0,05 par un test t non apparié bilatéral dans Excel. Abréviations : STX6 = syntaxine 6 ; Baf = bafilomycine A1 ; DMSO = sulfoxyde de diméthyle ; TSG101 = gène de susceptibilité tumorale 101 ; LC3 = protéines associées aux microtubules 1A/1B chaîne légère 3B ; PCNA = antigène nucléaire de cellule proliférante ; S.E.M. = erreur-type de la moyenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig02.jpg"> 
Figure 2 : Analyse d’images confocales de cellules HeLa co-exprimant Lamp1-GFP et mCherry-LC3 transfectées avec le témoin ou le siRNA STX6 dans les conditions traitées par véhicule et Baf. (A) Des images confocales de cellules HeLa exprimant de manière stable LAMP1-GFP et mCherry-LC3 ont été transfectées avec un siRNA témoin ou STX6 pendant 48 h, suivies d’une exposition au DMSO ou à 400 nM Baf pendant 4 h. Barre d’échelle = 20 μm. (B,C) La qunatification des autophagosomes (points négatifs LAMP1-GFP et positifs mCherry-LC3) et des autolysosomes (points doublement positifs LAMP1-GFP et mCherry-LC3) a été réalisée à l’aide du logiciel Fiji. Les données des graphiques à barres sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± S.E.M. (N = 3). * indique P &lt; 0,05, basé sur un test t non apparié à deux queues dans Excel. Abréviations : Lamp1 = protéine membranaire associée aux lysosomes 1 ; LC3 = protéines associées aux microtubules 1A/1B chaîne légère 3B ; STX6 = syntaxine 6 ; Baf = bafilomycine A1 ; GFP = protéine fluorescente verte ; S.E.M. = erreur-type de la moyenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig03.jpg"> 
Figure 3 : Imagerie confocale de cellules HeLa exprimant GFP-ATG13, transfectées avec un siRNA témoin ou STX6, et soumises à un traitement Vehicle ou Baf. (A) Les cellules HeLa ont été transfectées avec un témoin ou un siRNA STX6, suivies d’une transfection pEGFP-C1-hAtg13, et traitées avec du DMSO ou 400 nM Baf pendant 4 h. Barre d’échelle = 20 μm. (B) Les intensités relatives du signal ont été déterminées en normalisant le signal dans chaque condition à celui des cellules témoins transfectées par siRNA traitées avec Baf. Le graphique à barres montre les données en moyennes ± S.E.M. (N = 3). * indique P &lt; 0,05 par le test t bilatéral non apparié dans Excel. Abréviations : hAtg13 = gène 13 lié à l’autophagie humaine ; STX6 = syntaxine 6 ; Baf = bafilomycine A1 ; DMSO = sulfoxyde de diméthyle ; S.E.M. = erreur-type de la moyenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire S1 : Analyse par immunotransfert des fractions cellulaires, P1 et P2 des cellules HeLa transfectées avec un siRNA témoin et traitées avec Baf. Les cellules HeLa ont été transfectées avec des siRNA témoins et exposées à 100 nM Baf pendant 24 h. Des fractions ont ensuite été préparées : cellule, P1 (20 000 × g de granulés) et P2 (110 000 × g de granulés). Images immunoblot représentatives d’ULK1 et de PCNA, montrant leurs niveaux dans chaque fraction à des fins de comparaison. Abréviations : Baf = bafilomycine A1 ; ULK1 = unc-51 comme l’autophagie activant la kinase 1 ; PCNA = antigène nucléaire de cellule proliférante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385_Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Évaluation de la libération de LC3-II via les vésicules extracellulaires en relation avec l’accumulation de vésicules intracellulaires LC3-positives

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

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Évaluation du flux autophagique en mesurant LC3, p62 et LAMP1 Co-localisation à l&#39;aide de la cytométrie de flux d&#39;imagerie multispectrale

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Évaluation de la libération de LC3-II via les vésicules extracellulaires en relation avec l’accumulation de vésicules intracellulaires LC3-positives (Vidéo) | JoVE Journal

Évaluation de la libération de LC3-II via les vésicules extracellulaires en relation avec l’accumulation de vésicules intracellulaires LC3-positives

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