Évaluation de la libération de LC3-II via les vésicules extracellulaires en relation avec l’accumulation de vésicules intracellulaires LC3-positives

Nos recherches portent sur les maladies neurodégénératives progressives caractérisées par l’accumulation de la protéine nucléaire TDP-43 dans le cytoplasme, telles que la SLA ou la FTLD-TDP. Notre objectif est de comprendre comment les pathologies de la TDP-43 se propagent dans le cerveau de manière prionnienne. Nous avons précédemment constaté que la libération de TDP-43 via les vésicules extracellulaires est médiée par la dérégulation de l’autophagie.

La progranuline de la FTLD-TDP facilite ce processus. Le prochain défi consiste à clarifier comment l’autophagie régule la production et la libération de vésicules extracellulaires contenant du TDP-43, ce qui pourrait conduire à la découverte de cibles thérapeutiques pour la SLA ou la FTLD-TDP. Pour commencer, prenez les cellules HeLa cultivées, comptez-les à l’aide d’un compteur de cellules et ensemencez une fois dix à la puissance six cellules sur une plaque de six centimètres contenant un milieu de culture.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et une humidité contrôlée pendant 24 heures. Ensuite, préparez une solution de siRNA de 20 micromolaires. Mélangez 100 microlitres de milieu sérique réduit et trois microlitres de siRNA dans un tube à faible rétention pour préparer la solution A.Ensuite, mélangez 100 microlitres de milieu sérique réduit et cinq microlitres de réactif de transfection dans un tube à faible rétention pour préparer la solution B.Après cela, mélangez la solution A et la solution B, puis incubez le mélange à température ambiante pendant cinq minutes.

Ajoutez maintenant le mélange des solutions A et B dans le milieu utilisé pour la culture des cellules HeLa et incubez pendant 24 heures. Le lendemain, lavez les cellules avec du PBS et exposez-les à 500 microlitres de trypsine à 0,25 % et à une solution d’EDTA millimolaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et une humidité contrôlée pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez 2,5 millilitres de milieu de culture dans les cellules et, à l’aide d’une pipette de transfert Pasteur avec une pointe de pipette de 20 microlitres, préparez une suspension unicellulaire.

Après avoir compté les cellules, ensemencez une fois dix à la puissance six cellules sur une plaque de dix centimètres et incuberez, comme démontré précédemment. À la fin de l’incubation, préparer le milieu de culture contenant soit le véhicule, soit 100 nanomolaires de bafilomycine A1. Ensuite, exposez les cellules au milieu contenant soit le véhicule, soit 100 nanomolaires de bafilomycine A1 et incubez pendant 24 heures. Le lendemain, récupérez tout le milieu de culture de la plaque de 10 centimètres.

Transférez le milieu collecté dans un tube de 15 millilitres et centrifugez-le à 3 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Pour isoler la fraction vésiculaire extracellulaire P1, transférez le surnageant après centrifugation à 3 000 G dans un tube de centrifugation. Centrifugez le tube à 20 000 G à quatre degrés Celsius pendant une heure.

Pour l’isolement de la fraction vésiculaire extracellulaire P2, transférez le surnageant après centrifugation à 20 000 G dans un tube ultra-centrifuge. Centrifugez-le à 110 000 G à quatre degrés Celsius pendant une heure. Après avoir essuyé l’excès d’humidité à l’intérieur du tube avec une lingette de laboratoire, remettez en suspension les granulés restants dans le tube de centrifugation dans 50 microlitres de tampon d’échantillon à deux temps pour préparer la fraction de vésicule extracellulaire P1.

Retirez ensuite le surnageant par décantation. Essuyez l’excès d’humidité à l’intérieur du tube avec une lingette de laboratoire et mettez à nouveau en suspension les pastilles restantes dans le tube d’ultracentrifugation dans 50 microlitres de tampon d’échantillon à deux temps pour préparer la fraction de vésicule extracellulaire P2. Incuber les fractions de vésicules extracellulaires P1 et P2 à 100 degrés Celsius sur un bloc chauffant pendant 10 minutes.

Après avoir transféré le milieu de culture de la plaque de 10 centimètres dans un tube de 15 millilitres, lavez les cellules dans la boîte de 10 centimètres avec du PBS. Ensuite, exposez les cellules à deux millilitres de trypsine à 0,25 % et à une solution d’EDTA millimolaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et une humidité contrôlée pendant cinq minutes. Ajoutez huit millilitres de milieu de croissance aux cellules.

À l’aide d’une pipette de transfert Pasteur munie d’une pointe de pipette de 200 microlitres, pipetez les cellules pour préparer une suspension unicellulaire. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et centrifugez-la à 1 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez ensuite le surnageant à l’aide d’un aspirateur.

Ajouter du PBS à la pastille cellulaire et centrifuger à 1 000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le PBS, sonicez la pastille cellulaire dans un millilitre de tampon A68 contenant 1 % de sarcosil. Mélangez 300 microlitres de lysat cellulaire avec 100 microlitres de tampon d’échantillon à quatre temps.

Incuber le mélange à 100 degrés Celsius sur un bloc de chaleur pendant 10 minutes pour préparer la fraction cellulaire.