Name: Marquage fluorescent et encapsulation d’ARN longs pour la microscopie FRET-TIRF à molécule unique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Découvrez le marquage fluorescent et l'encapsulation d'ARN longs pour la microscopie FRET-TIRF à molécule unique. Cette méthode permet d'étudier la dynamique des ARN catalytiques en temps réel.

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<meta charset="utf8"></head><body>Marquage bicolore des extrémités et encapsulation vésiculaire d’ARN pour les études smFRET-TIRF

<ol><li>Eitan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+dynamic+structural+biology%3A+Challenges%2C+perspectives+and+an+appeal+for+open-science+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices.</a> Elife. 10, e60416(2021).</li>
<li>Taekjip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer at the single-molecule level.</a> Nat Rev Methods Primers. 4, 22(2024).</li>
<li>Ahunbay, E., Steffen, F. D., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+dual+end-labeling+of+large+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical dual end-labeling of large ribozymes.</a> Methods Mol Biol. 2439, 191-204 (2022).</li>
<li>Ahunbay, E., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+Introns%3A+Highly+structured+yet+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia+%28Aarau%29%22%5BJournal%5D)">Group II Introns: Highly structured yet dynamic.</a> Chimia (Aarau). 77 (4), 235-241 (2023).</li>
<li>Steiner, M., Karunatilaka, K. S., Sigel, R. K. O., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+group+II+intron+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of group II intron ribozymes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (37), 13853-13858 (2008).</li>
<li>Karunatilaka, K. S., Solem, A., Pyle, A. M., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+Mss116-mediated+group+II+intron+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of Mss116-mediated group II intron folding.</a> Nature. 467 (7318), 935-939 (2010).</li>
<li>Paudel, B. P., Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+crowding+accelerates+group+II+intron+folding+and+maximizes+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular crowding accelerates group II intron folding and maximizes catalysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (47), 11917-11922 (2018).</li>
<li>Saha, R., Verbanic, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+vesicles+chaperone+an+encapsulated+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid vesicles chaperone an encapsulated RNA aptamer.</a> Nat Commun. 9 (1), 2313(2018).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+surface-tethered+lipid+vesicles+as+a+new+tool+for+single+biomolecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Immobilization in surface-tethered lipid vesicles as a new tool for single biomolecule spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Cisse, I., Okumus, B., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+protein+DNA+interactions+inside+porous+nanocontainers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Fueling protein DNA interactions inside porous nanocontainers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (31), 12646-12650 (2007).</li>
<li>Zelger-Paulus, S., Hadzic, M. C. A. S., Sigel, R. K. O., Börner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+fluorescently+labeled+RNAs+into+surface-tethered+vesicles+for+single-molecule+FRET+studies+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of fluorescently labeled RNAs into surface-tethered vesicles for single-molecule FRET studies in TIRF microscopy.</a> Methods Mol Biol. 2331, 1-16 (2020).</li>
<li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li>
<li>Ishitsuka, Y., Okumus, B., Arslan, S., Chen, K. H., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-independent+porous+nanocontainers+for+single-molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-independent porous nanocontainers for single-molecule fluorescence studies.</a> Anal Chem. 82 (23), 9694-9701 (2010).</li>
<li>Liu, B., Mazouchi, A., Gradinaru, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+single+molecules+in+liposomes%3A+surface+interactions+and+freeze-thaw+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Trapping single molecules in liposomes: surface interactions and freeze-thaw effects.</a> J Phys Chem B. 114 (46), 15191-15198 (2010).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
<li>Paul, T., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+generation+and+regeneration+of+PEG-passivated+slides+for+single-molecule+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101152(2022).</li>
<li>Hadzic, M. C. A. S., Kowerko, D., Börner, R., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. Detailed analysis of complex single molecule FRET data with the software MASH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHadzic%2C+MCAS+%22Imaging%2C+Manipulation%2C+and+Analysis+of+Biomolecules%2C+Cells%2C+and+Tissues+IX%22">Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues IX</a>. Farkas, D. L., Nicolau, D. V., Leif, R. C. SPIE 971119, (2016).</li>
<li>Chu, B. C., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Le+Orgel.+Derivatization+of+unprotected+polynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Le Orgel. Derivatization of unprotected polynucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 11 (18), 6513-6529 (1983).</li>
<li>Qin, P. Z., Pyle, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorophores+and+other+structural+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of RNA with fluorophores and other structural probes.</a> Methods. 18 (1), 60-70 (1999).</li>
<li>Whitfeld, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+determination+of+nucleotide+sequence+in+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A method for the determination of nucleotide sequence in polyribonucleotides.</a> Biochem J. 58 (3), 390-396 (1954).</li>
<li>Zamecnik, P. C., Stephenson, M. L., Scott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+soluble+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Partial purification of soluble RNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 46 (6), 811-822 (1960).</li>
<li>Proudnikov, D., Mirzabekov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+of+DNA+and+RNA+fluorescent+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling.</a> Nucleic Acids Res. 24 (22), 4535-4542 (1996).</li>
<li>Wang, P. Y., Sexton, A. N., Culligan, W. J., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbodiimide+reagents+for+the+chemical+probing+of+RNA+structure+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Carbodiimide reagents for the chemical probing of RNA structure in cells.</a> RNA. 25 (1), 135-146 (2019).</li>
<li>Mitchell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+RNA+structural+probing+of+uracil+and+guanine+base-pairing+by+1-ethyl-3-%283-dimethylaminopropyl%29carbodiimide+%28EDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">In vivo RNA structural probing of uracil and guanine base-pairing by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC).</a> RNA. 25 (1), 147-157 (2019).</li>
<li>Rinaldi, A. J., Suddala, K. C., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+purification+and+labeling+of+RNA+for+single+molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Native purification and labeling of RNA for single molecule fluorescence studies.</a> Methods Mol Biol. 1240, 63-95 (2015).</li>
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<li>Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+in+vivo+Environment--The+Effect+of+Crowding+on+RNA+and+Biomacromolecular+Folding+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia%22%5BJournal%5D)">Mimicking the in vivo Environment--The Effect of Crowding on RNA and Biomacromolecular Folding and Activity.</a> Chimia. 69 (4), 207-212 (2015).</li>
<li>Peng, H., Lelievre, A., Landenfeld, K., Müller, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+stabilizes+intermolecular+association+and+structure+formation+of+functional+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation stabilizes intermolecular association and structure formation of functional RNA and DNA.</a> Curr Biol. 32 (1), 86-96.e6 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><Marquage >ARN fort</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp ; mL DNA LoBind tubes&nbsp ;</td><td>Eppendorf&nbsp ;</td><td></td><td></td>30108035</tr><tr><td>Chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC-HCl ou EDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11844071</td><td>Pierce EDC, format sans poids. Magasinez à&nbsp ; -20 &deg ; Acide C</td></tr><tr><td>3-morpholinopropane-1-sulfonique (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, pour la biologie moléculaire, &ge ; 99.5 % (titrage)</td></tr><tr><td>Acide acétique (glacial)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00063</td><td>100 %, anhydre pour l’analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Unité de filtration centrifuge&nbsp ;</td><td>Sartorius</td><td>VS0132</td><td>Vivaspin 500, MWCO 50.000, PES, 500 &mu ; L</td></tr><tr><td>Cyanine5 hydrazide (Cy5-hydrazide)</td><td>Lumiprobe</td><td>23070 5</td><td>mg, numéro CAS 1427705-31-4&nbsp ;</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>New England Biolabs</td><td>12611P</td><td>Qualité biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>Absolu &ge ; 99,8 %</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>pour la biologie moléculaire, &ge ; 99.0 %</td></tr> <tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00317</td><td>fumant 37 %, pour l’analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>98 %</td></tr><tr><td>Acétate de sodium (NaOAc)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>anhydre, ReagentPlus, &ge ; 99,0 %</td></tr><tr><td>Méta-parodaate de sodium (NaIO4)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Life Technologies</td><td>20504</td><td>Gamme de produits Pierce</td></tr><tr><td>Sulfo-Cyanine3 amine (sCy3-amine)</td><td>Lumiprobe</td><td>213C0</td><td>5 mg, numéro CAS 2183440-43-7</td></tr><tr><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)</td><td>Biosolve</td><td>200923</td><td>Biologie moléculaire grade</td></tr><tr><td><fort>Préparation de la chambre</ fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl)triéthoxysilane (APTES)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>99 %</td></tr> <tr><td>Acétone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00014</td><td>pour l’analyse EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Biotine-Polyéthylène glycol-Valérate de Succinimidyle (biotine-PEG-SVA, bPEG) et Méthoxypolyéthylène glycol-Valérate de Succinimidyle (mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td>BIO-PEG-SVA, MW 5,000 et MPEG-SVA, MW 5,000 - Kit</td></tr><tr><td>combo lamelles</td><td>Carl Roth</td><td>H876.2</td><td>24 x 24 mm, 0.13-0.16&nbsp ; mm épaisseur</td></tr><tr><td>Deconex 11 universal</td><td>Borer Chemie AG</td><td>17416492</td><td>Solution de nettoyage de verrerie</td></tr><tr><td>de laboratoire Trépan à revêtement diamanté</td><td>Crystalite corporation</td><td></td><td>1 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td>Perceuse</td><td></td><td></td><td></td>au diamant</tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>Absolute &ge ; 99,8 %</td></tr><tr><td>Verre Coplin Pot de coloration avec couvercle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intercalaire d’imagerie</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>SecureSeal, 8 puits,&nbsp ; 9&nbsp ; mm & fois ; 0,12&nbsp ; mm</td></tr><tr><td>Nettoyeur plasma à oxygène</td><td>Zepto One</td><td></td><td>Diener</td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>pour la biologie moléculaire, &ge ; 99.0 %</td></tr><tr><td>Diapositives en quartz</td><td>G. Finkenbeiner, Inc.</td><td></td><td>7,5 à 20 000 x&nbsp ; 2,5 à 2,5 cm, 1 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium (NaHCO3)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>BioXtra, 99,5-100,5 %</td></tr><tr><td><fort>Préparation de gâteau lipidique</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16:0 Biotinyl Cap PE, bPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sel de sodium), C53H98N4O11PNaS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870277P</td><td>Stable pendant 1 an à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>14:0 PC, DMPC (1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ou 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, C36H72NO8P)</td><td>Tubes microcentrifuges Avanti Polar Lipids</td><td>850345P</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL, Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>Autoclave pour stériliser</td></tr><tr><td>500&nbsp ; mL Fiole</td><td></td><td></td><td></td>Schlenk</tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Merck</td><td>1.02445</td><td>pour analyse EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilisation de surface par encapsulation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn ;)-Acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique (Trolox&reg ;)</td><td>Thermo Fischer</td><td>53188-07-1</td><td>Acide 97%</td></tr><tr><td>3-morpholinopropane-1-sulfonique (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, pour la biologie moléculaire, &ge ; 99,5 % (titrage). Magasin à +4 &deg ; C dans l’obscurité.</td></tr><tr><td>Languettes d’étanchéité adhésives</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp ;</td><td>629200</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-05-2, C30</td><td>du foie de bovin, suspension aqueuse, 10 000-40 000 unités/mg de protéine</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>&ge ; 99,5 % (GC), BioXtra</td></tr><tr><td>Extruder membrane polycarbonate (PC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005-1EA</td><td>0.1 &mu ; m, 19 mm</td></tr><tr><td>Kit d’extrudeuse avec bloc chauffant</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose oxydase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-37-0</td><td>de Aspergillus niger, Type VII, &nbsp ; poudre lyophilisée, &ge ; 100 000 unités/g solide (sans oxygène ajouté)</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3, M1028</td><td>pour la biologie moléculaire, 1,00 M &plusmn ; 0,01 M solution</td></tr><tr><td>Disque de drainage en polyester (PE), membrane</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>230300</td><td>10 mm</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td>BioUltra, pour la biologie moléculaire, &ge ; 99,5 % (AT)</td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>pour la biologie moléculaire, &ge ; 99.0 %</td></tr><tr><td>Streptavidine</td><td>Thermo Fischer</td><td>434301</td><td></td></tr></tbody></table>

marquage fluorescent et encapsulation d’arn longs pour la microscopie fret-tirf à molécule unique

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

Nous présentons le marquage fluorescent simple et double spécifique du site de l’ARN 915-nt d’intérêt, l’inton mitochondrial de levure Sc.ai5γ du groupe II, flanqué de séquences exoniques. La paire de fluorophores FRET est positionnée aux extrémités de l’ARN via l’activation EDC/NHS du 5'-phosphate et l’oxydation périodique du 3'-ribose, suivie des attaches de colorant respectives. Nous avons ensuite vérifié les conjugués ARN-colorant par électrophorèse sur gel fluorescent, comme présenté à la figure 4A. La co-migration de l’ARN et des fluorophores sur le gel d’agarose confirme le marquage réussi. Ensuite, comme le montre la figure 4B, la spectroscopie de fluorescence d’ensemble a été utilisée pour caractériser l’intron du groupe II à double marque. Un transfert d’énergie, c’est-à-dire un FRET, a été observé lors de l’excitation du colorant donneur, prouvant le double marquage de l’ARN. Notamment, conformément à la nature dépendante de la distance du FRET, le repliement de l’ARN de l’intron du groupe II en présence d’ions métalliques a conduit à une augmentation de l’efficacité du FRET, comme en témoigne la diminution de l’émission du donneur (flèche verte) et une augmentation correspondante de l’émission de l’accepteur (flèche rouge). Cela indique que ce marquage FRET suit les changements conformationnels du ribozyme.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig04.jpg"> 
Figure 4 : Caractérisation des conjugués ARN-colorant. (A) L’analyse analytique sur gel d’ARN marqués par fluorescence simple et double montre la co-migration des colorants avec l’ARN sur un gel d’agarose à 2 %. La co-localisation des fluorophores dans l’échantillon à double marquage est indiquée par la bande jaune dans l’image fusionnée (en bas) des canaux Cy3 (en haut, vert) et Cy5 (au milieu, rouge), visualisés sous un éclairage de 532 nm et 635 nm, respectivement. Voie 1 : ARN marqué uniquement 5'-sCy3, voie 2 : ARN marqué uniquement 3'-Cy5 et voie 3 : ARN marqué à double extrémité (5'-sCy3 et 3'-Cy5). (B) La spectroscopie de fluorescence d’ensemble confirme le double marquage. Le transfert d’énergie lors de l’excitation du donneur (λex = 515 nm, λem = 670 nm) vérifie que les deux colorants sont couplés avec succès à l’ARN. La courbe grise représente le profil d’émission de l’ARN précatalytique, tandis que la courbe noire démontre une efficacité accrue de la FRET dans l’ARN intron replié du groupe II (incubé avec 500 mM de KCl à 70 °C pendant 3 min, refroidi à 42 °C pendant 5 min, suivi de l’ajout de 100 mM de MgCl2). Cette figure a été adaptée de Ahunbay et al.3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Avec l’intron de type sauvage du groupe II à double marquage fluorescent en main, nous sommes maintenant en mesure d’explorer sa dynamique au niveau de la molécule unique. Une fois encapsulé dans des vésicules phospholipidiques, l’ARN marqué est immobilisé sur une surface de microscopie à de très faibles densités de surface pour obtenir une résolution moléculaire pour smFRET-TIRF. Comme le montre la figure 5A, plusieurs molécules individuelles peuvent être suivies simultanément. La microscopie TIRF permet de surveiller en temps réel l’efficacité du FRET et ses changements au fil du temps. La figure 5B illustre les traces FRET statiques et dynamiques d’une seule molécule de l’ARN marqué et encapsulé. Une trace dynamique typique présente une anticorrélation entre les signaux du donneur et de l’accepteur qui fluctue l’efficacité du FRET. Lorsque l’émission de l’accepteur lors de l’excitation du donneur augmente, l’émission du donneur diminue en conséquence, indiquant un changement dynamique de la distance entre les colorants. Cette anticorrélation suggère des changements conformationnels dans la molécule d’ARN.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig05.jpg"> 
Figure 5 : Comportement hautement dynamique de l’ARN intron du groupe II révélé par smFRET. L’ARN de l’intron du groupe II marqué à deux extrémités est encapsulé dans une vésicule phospholipidique et immobilisé à la surface pour l’imagerie avec un microscope TIRF à base d’objectifs. (A) Image fusionnée de molécules d’ARN marquées individuelles présentant une émission donneuse (sCy3, vert) et une émission accepteur (Cy5, rouge) lors d’une excitation de 532 nm. (B) Les trajectoires smFRET typiques (à gauche) d’une molécule d’ARN statique où les intensités donneuse et accepteuse ne fluctuent pas dans le temps et (à droite) d’une molécule d’ARN dynamique, où les intensités donneuse et accepteuse s’anticorrélent, avec les efficacités FRET en jaune. Les molécules uniques sont localisées et analysées à l’aide de MASH-FRET17. Des corrections directes d’excitation, de saignement et de γ facteurs sont appliquées. Abréviations : smFRET = single-molecule Förster Resonance Energy Transfer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Marquage fluorescent et encapsulation d’ARN longs pour la microscopie FRET-TIRF à molécule unique

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

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