Marquage fluorescent et encapsulation d’ARN longs pour la microscopie FRET-TIRF à molécule unique

Nos recherches portent sur la dynamique des ARN actifs catalytiques et sur la façon dont ces dynamiques changent dans différentes conditions environnementales. Nous utilisons le FRET à molécule unique pour étudier l’influence de facteurs tels que les lignes médianes monovalentes et divalentes, les protéines chaperonnes et les agents d’encombrement sur la dynamique de l’ARN. Il est difficile d’incorporer avec précision des fluorophores donneurs et accepteurs sans perturber la structure et la fonction de l’ARN.

De plus, le suivi du repliement d’un grand ARN dynamique est difficile. Cependant, le protocole de marquage et d’encapsulation établi nous permet de suivre la dynamique de repliement de l’ARN fonctionnel au fil du temps. Notre protocole relève le défi de l’observation de grands ARN catalytiquement actifs en temps réel et dans des conditions néophysiologiques.

En marquant et en encapsulant de manière covalente l’ARN et les vésicules, qui sont ensuite immobilisés en surface, nous pouvons surveiller la fonction de l’ARN avec le TIRF à molécule unique. Nous nous concentrons sur le marquage FRET covalent des ARN catalytiques longs et en particulier des introns du groupe II. Il s’agit d’un défi en raison de leur complexité structurelle.

Lorsqu’il est encapsulé dans des vésicules, nous parvenons à maintenir l’ARN dans le champ évanescent pour la microscopie TIRF, et pourtant l’ARN peut flotter librement. De cette façon, le smFRET peut révéler le comportement dynamique de l’ARN sans entrave. Nous continuerons d’essayer de comprendre comment la nature fonctionne réellement, en nous concentrant sur la relation structure-fonction et la dynamique des ribosomes, des ribocommutateurs et d’autres ARN régulateurs en utilisant une approche multitechnique.

Ainsi, s’orienter vers des investigations dans des conditions physiologiques et cellulaires sera un axe majeur de nos travaux à l’avenir. Pour commencer, aliquote l’ARN d’intérêt, ayant 50 à 75 microgrammes d’ARN par tube dans 55 microlitres d’eau doublement distillée, puis ajoutez 45 microlitres du mélange d’acétate de sodium EDC/NHS pH 6 à l’ARN. Incuber le mélange pendant quatre heures à 25 degrés Celsius en secouant à 500 tr/min.

Après l’incubation, remettre en suspension la pastille d’ARN activée dans 95 microlitres de tampon MOPS de 100 millimolaires pH 7,5. Ajoutez ensuite cinq microlitres de cyanine-3 amine sulfonée de deux millimolaires à l’ARN activé, et incubez à 25 degrés Celsius pendant 16 heures à 500 tr/min pour coupler le fluorophore au phosphate 5 amorceux activé. Le lendemain, ajoutez 200 microlitres d’eau doublement distillée pour améliorer la séparation.

Ensuite, purifier l’ARN marqué au phosphate 5-prime par précipitation d’éthanol. Après la purification, remettre en suspension l’ARN marqué dans 100 microlitres de tris HCl de 100 millimolaires et incuber pendant deux heures à 25 degrés Celsius. Ensuite, pour éliminer les colorants libres, lavez l’ARN marqué dans de l’eau bidistillée avec filtration centrifuge.

Pour le marquage à double extrémité, aliquote l’ARN marqué à 5 extrémités, avec environ 50 à 75 microgrammes d’ARN par tube dans 90 microlitres de solution. Ajoutez cinq microlitres de tampon molaire d’acétate de sodium à pH 5,5. Ajoutez ensuite quatre microlitres de solution mère de métaperiodate de sodium de 500 millimolaires fraîchement préparée.

Pour un étiquetage unique à 3 extrémités, ajoutez huit microlitres de solution mère de métapériodique. Après avoir incubé les solutions dans l’obscurité pendant deux heures, pipetez 30 microlitres de glycérol à 50% pour arrêter la réaction. Après 30 minutes d’incubation, ajoutez 400 microlitres de mélange de précipitation d’éthanol et d’acétate de sodium glacé.

Remettre en suspension la pastille d’ARN oxydé dans 95 microlitres de tampon d’acétate de sodium de 50 millimolaires pH six. Purifier l’ARN à double extrémité par précipitation d’éthanol et filtration centrifuge, comme démontré précédemment. Éluer l’ARN purifié dans de l’eau bidistillée.

Comparez visuellement les couleurs du surnageant et de la pastille obtenues après chaque étape. Calculez les concentrations d’ARN et de colorant conjugué sur un spectrophotomètre UV-visible. L’électrophorèse sur gel fluorescent a confirmé le succès du marquage simple et double de l’ARN, comme le montre la comigration de l’ARN avec les fluorophores.

L’efficacité du FRET a augmenté en présence d’ions métalliques, indiquant un repliement de l’ARN, ce qui a entraîné une diminution de l’émission du donneur et une augmentation de l’émission de l’accepteur. Pour préparer une chambre microfluidique, utilisez une foreuse au diamant pour percer quatre trous dans les lames de quartz pour former deux canaux. Placez les lames de quartz percées et environ deux fois plus de lamelles dans un bocal de coloration Coplin en verre avec un couvercle.

Sonicez les lames et les lamelles dans de l’eau doublement distillée pendant cinq minutes. Ensuite, imprégnez le pot d’une solution de nettoyage de verrerie à 10 % pendant 30 minutes à 50 degrés Celsius. Après avoir rincé le pot avec de l’eau doublement distillée, sonicate dans une solution molaire d’hydroxyde de potassium pendant 30 minutes et laissez-le dans la solution pendant la nuit.

Après des rinçages répétés et une sonication à l’eau distillée, séchez les lames et les lamelles à l’aide d’un flux d’azote gazeux. Traitez les lames et les lamelles séchées avec un nettoyeur plasma à l’oxygène pendant 30 minutes. Placez les lames et les lamelles propres dans un bocal de coloration Coplin contenant une solution d’éthanol de test AP à 3 % de sonicate pendant une minute, puis incubez pendant 30 minutes.

Rincez les lames et les lamelles trois fois chacune avec de l’éthanol absolu et de l’eau bidistillée, puis séchez-les sous flux d’azote gazeux. Ensuite, préparez une boîte humide en remplissant à moitié une boîte à pointes de pipette vide avec de l’eau distillée deux fois. Placez les lames à l’intérieur de la boîte avec le côté à traiter vers le haut.

Ajoutez des gouttelettes de 30 microlitres de mélange bPEG/mPEG fraîchement préparé au centre de la lame pour couvrir les deux canaux. Couvrez la gouttelette avec une lamelle propre et fermez la boîte humide. Incuber la boîte toute la nuit dans l’obscurité pour la pégylation.

Le lendemain, rincez les lames et lamelles passivées et biotinylées avec de l’eau doublement distillée et observez le changement d’hydrophobie des surfaces traitées. Fixez l’autocollant recto-verso à la diapositive, en vous assurant que l’autocollant couvre la zone d’intérêt. Placez ensuite soigneusement la lamelle sur le dessus de la lame, en alignant les surfaces PEGylées pour qu’elles se fassent face.

Transférez la chambre assemblée dans un tube de centrifugation de 50 millilitres et remplissez le tube d’azote gazeux. Pour commencer, utilisez une aiguille stérile pour percer un trou de l’intérieur vers l’extérieur dans le couvercle d’un tube stérile propre de deux millilitres. Ajoutez 109 microlitres de mélange bPE-DMPC dans le tube.

Placez un insert de cloison de cellule en carton d’une boîte de stockage de microtubes dans une fiole Schlenk de 500 millilitres pour servir de porte-tube. À l’aide d’une longue pince à épiler, placez soigneusement les tubes contenant le mélange de lipides dans le porte-tube. Évaporez le chloroforme sous un faible débit d’azote gazeux pendant la nuit.

Après avoir obtenu la couche lipidique séchée, scellez les tubes avec du parafilm pour couvrir les trous. Assemblez l’extrudeuse à l’aide d’une membrane en polycarbonate de 100 nanomètres et d’un disque de drainage en polyester de 10 millimètres. Équilibrez la seringue et les membranes avec un tampon anti-clignement.

Après avoir mélangé l’ARN marqué à double extrémité avec un tampon anti-clignement, hydratez le gâteau lipidique avec un mélange de tampon anti-clignement d’ARN à 30 degrés Celsius. Agitez pendant cinq minutes à 1 400 tr/min, puis 15 minutes à 700 tr/min. Centrifugez le mélange pendant deux minutes à 13 000 G et diluez le surnageant avec 250 microlitres de tampon anti-clignement.

Remplissez la seringue avec la suspension lipidique d’ARN et extrudez 35 fois à 30 degrés Celsius sur un bloc chauffant pour encapsuler l’ARN à double extrémité dans des vésicules phospholipidiques de 100 nanomètres de diamètre. Rincez la chambre deux fois avec 200 microlitres de tampon standard 5X à température ambiante. Remplissez la chambre avec 50 microlitres de solution de streptavidine à 20 microlitres par millilitre et incubez pendant cinq minutes.

Rincez ensuite la chambre avec 200 microlitres de tampon standard et 100 microlitres de tampon anti-clignement. Ajouter 75 microlitres de suspension vésiculaire et incuber pendant 10 minutes pour l’immobilisation de l’ARN encapsulé en surface. Après l’immobilisation, rincez la chambre avec 200 microlitres de tampon d’imagerie fraîchement préparé.

Pour l’acquisition de données, montez la chambre sur le microscope TIRF et acquérez des données smFRET avec excitation laser alternée. L’imagerie FRET d’une molécule unique à l’aide de la microscopie TIRF a suivi les molécules d’ARN individuelles et détecté les changements en temps réel de l’efficacité FRET. Des traces dynamiques de molécules uniques ont montré des fluctuations anti-corrélées entre les signaux du donneur et de l’accepteur, indiquant des changements de confirmation dans l’ARN.