Coloration vivante/morte pour quantifier les cellules viables mais non cultivables dans les bactéries causant des plaies traitées au miel de Manuka

Ce projet de recherche vise à étudier l’impact du miel de Manuka sur la physiologie bactérienne. Des études récentes ont fourni des informations supplémentaires sur les effets antimicrobiens du miel de Manuka sur la physiologie bactérienne. Nos résultats préliminaires indiquent que les bactéries du miel de Manuka entrent dans l’état de dormance résistante aux antibiotiques, viable mais non cultivable, mais dans une moindre mesure que celles traitées avec des antibiotiques conventionnels.

Sur la base de nos expériences, il serait intéressant de comparer les profils d’expression du miel de Manuka et des VBNC conventionnels induits par les antibiotiques. Pour commencer, prenez les flacons contenant des souches bactériennes congelées. Ouvrez chacun d’eux séquentiellement et utilisez un bâtonnet stérile pour gratter une petite quantité de bactéries congelées sur la plaque de gélose Luria-Bertani ou LB correctement étiquetée.

Remettez le bouchon du flacon et placez-le rapidement dans le congélateur. Incuber les cultures bactériennes pendant 18 à 24 heures à 37 degrés Celsius. Le lendemain, à l’aide d’une pipette sérologique, transférez deux millilitres de bouillon LB dans deux tubes à essai stériles.

Stérilisez l’anse d’inoculation dans la flamme du bec Bunsen. Transférez ensuite un quart de boucle de bactéries de la plaque de gélose LB dans le tube à essai correctement étiqueté contenant du bouillon LB. Incuber l’éprouvette dans des conditions aérobies dans un incubateur à agitation à environ 250 tr/min à 37 degrés Celsius pendant 18 à 24 heures.

Pour la mise en place du miel de Manuka et les traitements antibiotiques des bactéries, ajoutez 10 microlitres de culture bactérienne à 10 millilitres de bouillon Mueller Hinton pour obtenir la dilution de 1:1 000 de la culture bactérienne, qui a environ 10 à la sixième unités formant colonie par millilitre. Utilisez les cultures diluées pour préparer trois échantillons pour chaque espèce bactérienne, un témoin non traité, un échantillon traité au miel de Manuka et un échantillon traité aux antibiotiques. Ajoutez le miel de Manuka et l’antibiotique dans les tubes appropriés.

Transférez 0,1 millilitre et 0,5 millilitre de l’échantillon non traité dans des microtubes à centrifuger stériles pour une numération sur plaque viable et une coloration vivante/morte pour le T équivaut à zéro échantillon. Ensuite, incubez les échantillons de contrôle non traités, de miel de Manuka et traités aux antibiotiques dans des conditions aérobies à 37 degrés Celsius dans un incubateur à agitation à 250 tr/min pendant 24 heures. Préparez une dilution en série de dix fois de T égale à zéro échantillon non traité dans un bouillon LB afin d’obtenir un nombre dénombrable de cellules pour la numération sur plaque viable.

Étalez 50 microlitres de chaque échantillon dilué sur la moitié d’une plaque de gélose LB. Incuber les plaques de gélose dans des conditions aérobies à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, retirez les plaques de gélose LB de l’incubateur.

Identifiez la plaque de dilution contenant environ 25 à 150 colonies et comptez le nombre exact de colonies. Utilisez la formule de l’unité formant colonie pour déterminer le nombre de cellules cultivables par millilitre. Le troisième jour, ajoutez 0,5 millilitre de chlorure de sodium à 0,85 % à 0,5 millilitre de T, ce qui équivaut à zéro échantillon de contrôle de coloration vivante/morte non traité.

Combinez 1,5 microlitre de SYTO 9 et 1,5 microlitre d’iodure de propidium par échantillon. Ajoutez ensuite trois microlitres du mélange à chaque échantillon. Incuber les échantillons à 21 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 15 minutes.

Transférez six microlitres de l’échantillon coloré et délicatement mélangé dans un hémocytomètre jetable et visualisez-le au microscope fluorescent à l’aide d’un filtre isothiocyanate de fluorescéine ou FITC et d’un objectif 40X. Capturez une image montrant à la fois les lignes de la grille de l’hémocytomètre et les cellules vertes. Comptez les cellules vertes dans six champs par échantillon, en notant les dimensions de la grille pour calculer le nombre de cellules vertes par volume.

Enfin, calculez le nombre de cellules viables mais non cultivables en soustrayant le nombre de cellules cultivables par millilitre obtenu à l’aide de la numération sur plaque viable du nombre de cellules viables par millilitre obtenu à l’aide de la coloration vivante/morte. Le quatrième jour, après avoir retiré de l’incubateur les cultures bactériennes non traitées, traitées au miel de Manuka et traitées aux antibiotiques, collectez 0,1 millilitre et 0,5 millilitre de chaque échantillon dans des tubes de micro-centrifugeuse pour la numération sur plaque viable et la coloration vivante/morte. Cette figure montre le nombre de cellules cultivables et viables déterminé à l’aide de la numération sur plaque viable et de la coloration vivante/morte pour les cultures de S. aureus et de P. aeruginosa.

Les résultats montrent que le nombre de cellules viables et cultivables détectées dans les cultures non traitées et traitées au miel de Manuka n’était pas significativement différent. Les cultures de S. aureus traitées avec de la tobramycine avaient moins de cellules cultivables que de cellules viables, mais cette différence n’était pas significative. Seul P. aeruginosa traité au méropénème a montré une réduction statistiquement significative des cellules cultivables par rapport aux cellules viables.