Fabrication et marquage de microbulles à l’aide de traceurs fluorescents et radioactifs

Les microbulles sont des particules sensibles aux ultrasons remplies de gaz avec des capacités uniques d’imagerie et de thérapie du cancer. Leurs utilités en évolution peuvent être stratégiquement avancées en créant des microbulles traçables basées sur l’application. Nous visons à faciliter cet objectif en développant un protocole de fabrication de microbulles lipidiques qui permet la génération personnalisable de microbulles non marquées, radiomarquées, fluorescentes et multimodales.

Obtenir un marquage radio efficace et stable des microbulles est un défi non négligeable. Les microbulles lipidiques sont fragiles et, par conséquent, les soumettre à la chaleur, au temps et aux étapes de purification dans les approches de radiomarquage post-fabrication peut perturber leurs propriétés physico-chimiques et leur stabilité. D’autre part, l’étiquetage radio de préfabrication nécessite un équipement spécialisé et une exposition accrue aux rayonnements.

Nous surmontons ces défis en développant un nouveau protocole hybride dans lequel la chélation des radio-isotopes se produit avant l’activation des microbulles, mais après la formation d’une suspension lipidique. Cette approche à un seul pot permet pour la première fois le marquage radio de microbulles à haute efficacité, sans purification, qui préserve les propriétés physico-chimiques des particules. Un avantage supplémentaire clé est la polyvalence des protocoles. Il peut être incorporé lors de la fabrication de microbulles personnalisées broyées et adapté aux suspensions lipidiques de microbulles préformées telles que celles disponibles dans le commerce. Il peut être appliqué avec succès sur diverses compositions de microbulles lipidiques et de chélateurs, et peut en conséquence générer des microbulles radioactives, fluorescentes ou trimodales sur mesure.

Ensemble, ces propriétés permettent un traçage représentatif multimodal des enveloppes lipidiques à microbulles qui peut faire progresser les connaissances mécanistes et soutenir l’avancement des thérapies par ultrasons axées sur les microbulles dans de nombreux domaines, y compris l’étude pharmacocinétique des microbulles, l’imagerie multimodale, la planification du traitement et l’activation des thérapies synergiques.

[Narrateur] Pour commencer à utiliser une micro-pipette, ajoutez un millilitre de solution AA-PGG le long des bords du film lipidique à microbulles de votre choix dans un flacon, en évitant la formation de bulles. Couvrez partiellement l’ouverture du flacon avec le bouchon, en laissant suffisamment d’espace pour insérer la ligne de perfluoropentane ou de PFP. Versez le PFP dans l’espace de tête du flacon pendant 20 secondes au-dessus du liquide et bouchez le flacon. Plongez la moitié inférieure du flacon dans un bain-marie à 70 à 80 degrés Celsius pendant une minute. Ensuite, sonicez le flacon pendant 30 secondes dans des bains à 69 degrés Celsius. Après la sonication, essuyez le flacon et laissez-le refroidir à température ambiante. Remplissez l’espace libre du flacon avec du gaz PFP. Ensuite, bouchez le flacon et scellez les bords avec du Parafilm. Pour mettre en place un bain-marie à 60 degrés Celsius dans un plat en cristallisation, placez une barre d’agitation magnétique dans le plat et placez-la sur une plaque d’agitation chaude à température contrôlée. Insérez une sonde thermique dans l’eau pour surveiller la température et ajustez la vitesse d’agitation pour créer un entonnoir faible mais visible. À l’aide d’une pince, transférez un flacon scellé contenant du cuivre 64 sous forme de chlorure cupérique dans de l’acide chlorhydrique normal 0,1 dans un calibrateur de dose. Notez l’activité du cuivre 64 et l’heure. À l’aide d’une pince, retirez le flacon de l’étalonneur de dose et placez-le dans un récipient en plomb. Pour calculer la valeur en mégabecquerels par millilitre, il faut diviser l’activité notée sur l’étalonneur de dose par le volume de cuivre 64. Débouchez la suspension lipidique et fixez-la dans un porte-flacon. Ensuite, débouchez le flacon de cuivre 64 en manipulant le flacon avec une pince. À l’aide d’une micropipette, transvaser dans la suspension lipidique un volume de solution de cuivre 64 correspondant à 40 à 250 mégabecquerels d’activité. À l’aide d’une pince plate à pointe en caoutchouc, faites pivoter la suspension lipidique radioactive de haut en bas au moins cinq fois pour mélanger le cuivre 64 dans la suspension. Pendant que le flacon est à l’endroit, agitez doucement le bouchon tout en stabilisant le flacon. Débouchez soigneusement et partiellement le flacon et insérez une ligne PFP équipée d’une aiguille. Remplissez l’espace libre de la fiole avec du PFP pendant 20 secondes. Ensuite, bouchez et scellez le flacon avec du parafilm. Mesurez l’activité du flacon à l’aide d’un calibrateur de dose et notez l’heure. Ensuite, placez le flacon dans un porte-flacon en mousse de sorte que la moitié inférieure du flacon soit exposée à la chaleur. Immergez le support dans le bain-marie à 60 degrés Celsius et chauffez-le pendant une heure. Pendant ce temps, pour préparer les bandes iTLC, coupez le papier de chromatographie en microfibre de verre en bandes. Chauffez les bandes dans un four de séchage du verre à 80 degrés Celsius pour les activer. Au bout d’une heure, retirez la fiole du bain-marie et essuyez ses bords avec du papier de soie. Faites pivoter le flacon de haut en bas à l’aide d’une pince à pointe en caoutchouc. Pendant que le flacon est en position verticale, actionnez le capuchon tout en stabilisant le flacon. Retirez le parafilm et essuyez autour du capuchon pour éliminer toute eau emprisonnée. Repérez un à deux microlitres de suspension lipidique à un centimètre du centre inférieur d’une bandelette iTLC activée. Laissez sécher l’endroit. À l’aide d’une micropipette, ajoutez 200 microlitres d’éluant iTLC au fond d’un tube à essai de 10 millilitres. Rangez le tube dans un récipient en plomb. Ajoutez la bande iTLC tachetée dans le tube et laissez-la se développer jusqu’à ce que l’éluant atteigne environ un centimètre du haut de la bande. Ensuite, à l’aide d’une pince, retirez la bande développée et maintenez-la verticalement. Coupez la bande en trois sur des tubes en plastique de cinq millilitres compatibles avec les compteurs gamma. Insérez des capuchons poussoirs dans les tubes. Mesurez la bande contenant les tubes et un tube témoin vide à l’aide d’un compteur gamma pour détecter l’activité du cuivre 64. Enregistrez le nombre de compteurs par minute et soustrayez l’activité du tube de contrôle des autres lectures pour corriger le rayonnement de fond. Calculez ensuite la pureté radiochimique sur la base du nombre corrigé par minute. Ensuite, débouchez le flacon de suspension lipidique radiomarqué et ajoutez 8,89 microlitres d’un hydroxyde de sodium normal dans la suspension. Après avoir bouché et tourné le flacon, tapotez doucement le flacon pour retirer la suspension coincée dans l’espace du bouchon et remplissez l’espace libre avec du gaz PFP. Placez le flacon sur un agitateur mécanique et activez-le pendant 45 secondes à 4 530 tr/min pour générer une suspension de microbulles laiteuses. Lors du refroidissement passif à température ambiante, retournez doucement le flacon pour remettre en suspension la suspension de microbulles. Placez le flacon sur une surface plane et attendez deux minutes. Pendant ce temps, équipez une seringue en plastique d’un millilitre d’une aiguille de calibre 18 et ventilez la seringue en aspirant et en plongeant l’air vers l’intérieur et vers l’extérieur. Au bout de deux minutes, débouchez rapidement le flacon et aspirez 400 à 550 microlitres de suspension du fond du flacon. Essuyez soigneusement les bords de l’aiguille et transférez la suspension de microbulles dans un microtube à centrifuger. Après avoir bouché le tube, mesurez l’activité du produit final à microbulles sur un calibrateur de dose et notez le temps. Divisez la valeur de l’activité par le volume décanté pour obtenir l’activité en mégabecquerels par millilitre. Pour commencer, ajoutez 10 à 200 microlitres de suspension de microbulles à une unité de filtre centrifuge de coupure de 0,5 millilitre et de 30 000 poids moléculaire dans un tube de micro-centrifugeuse compatible. Centrifuger la suspension à 12 000 G pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper la connexion entre le tube de micro-centrifugeuse et son bouchon. Placez le bouchon dans un flacon à scintillation de 20 millilitres étiqueté CAPS. Transférez l’unité de filtration dans un nouveau micro-tube à centrifuger étiqueté TUBE 2. Placez le premier microtube de centrifugation contenant de l’infranatant dans un flacon à scintillation de 20 millilitres étiqueté TUBE 1. Ajoutez 200 microlitres d’eau double distillée dans l’unité de filtration du TUBE 2. Centrifugez à nouveau l’unité de filtration à 12 000 G pendant 10 minutes. Après le dernier transfert de l’unité de filtration, ajoutez 200 microlitres d’eau distillée dans l’unité de filtration dans le TUBE 3 et la centrifugeuse. Après la centrifugation, coupez le bouchon du tube, en l’ajoutant au flacon à scintillation du bouchon, et transférez l’unité de filtration dans un nouveau flacon à scintillation de 20 millilitres étiqueté UNIT. Placez le TUBE 3 dans un nouveau flacon à scintillation en verre de 20 millilitres. Bouchez les cinq flacons à scintillation et préparez un flacon à scintillation vide et bouché comme flacon de contrôle à blanc. Mesurez les six flacons à scintillation sur un compteur gamma pour détecter l’activité du cuivre 64. Soustrayez le contrôle à blanc des autres mesures du flacon. Calculez l’efficacité du marquage radio ou de la chélation.