Respirométrie à haute résolution dans une chambre de petit volume

Dans cette étude, nous voulons déterminer si la chambre de petit volume calibrée à 0,5 millilitre peut être utilisée dans des tests respiratoires sans compromettre la précision obtenue pour le volume classique de deux millilitres dans la plateforme Oroboros.

Le développement de la chambre de petit volume et l’évaluation par respirométrie à haute résolution avec un contrôle qualité rigoureux à l’aide de l’analyse de précision OXPHOS ont ouvert la voie à des développements, de nouvelles innovations, c’est-à-dire, premièrement, un respiromètre O2k à 12 chambres, deuxièmement, un robot pour les titrages automatiques de substances dans des protocoles complexes appliqués à l’analyse OXPHOS. Ces applications seront cruciales pour l’analyse mitochondriale, le diagnostic des maladies mitochondriales, l’évaluation des développements de médicaments en se concentrant à la fois sur les avantages des médicaments pour la fonction mitochondriale et sur les effets hors cible qui perturbent involontairement la fonction mitochondriale. Lorsque mon équipe a mis au point la respirométrie à haute résolution il y a plus de 30 ans, il y avait un paradigme selon lequel mitochondries, mitochondries, mitochondries. Peut-être y avait-il une différence entre les mitochondries musculaires et hépatiques, mais c’était tout. Personne ne s’intéressait vraiment aux mitochondries en dehors de ces paradigmes. Avec nos protocoles développés pour la respirométrie à haute résolution, nous avons montré une grande diversité de la fonction mitochondriale. Cela nous permet d’évaluer le contrôle respiratoire mitochondrial dans divers types de cellules, tissus et espèces avec un nouvel œil. Il y a 30 ans, il y avait environ 10 publications qui l’appréciaient. Aujourd’hui, nous avons avec notre instrument plus de 1 500 utilisateurs de ces protocoles.

Quatre fois moins d’échantillons sont nécessaires dans la chambre de petit volume par rapport à la chambre classique de deux millilitres. Dans le cas d’un échantillon avec une faible fréquence respiratoire, la même quantité d’échantillon peut être utilisée pour augmenter les flux d’oxygène spécifiques au volume afin de réduire l’incertitude de la mesure.

L’objectif de notre travail au sein du laboratoire de R&D d’Oroboros est de combiner développement instrumental et recherche académique. Nous évaluons la fonction respiratoire mitochondriale et les profils biogénétiques à l’aide d’une analyse multi-capteurs. Il s’agit de mesurer la respiration, les potentiels redox, le potentiel membranaire, l’absorption de calcium, la production de peroxyde d’hydrogène et divers autres paramètres qui nous permettent d’avoir un aperçu plus approfondi du profil biogénétique et de la fonction et du dysfonctionnement mitochondriaux.

[Narrateur] Pour commencer, montez le petit volume, ou chambre SV, sur l’Oroboros. Allumez ensuite l’Oroboros et cliquez sur Connecter pour connecter l’Oroboros au logiciel DatLab. Après avoir complètement séché les chambres, utilisez une pipette pour ajouter 0,54 millilitre d’eau dans la chambre SV. Allumez ensuite les touillettes. Avant de fermer la chambre, humidifiez les joints toriques des bouchons, en gardant le capillaire sec. Desserrez la bague d’étalonnage du volume, puis insérez le bouchon vers le bas jusqu’à ce que le liquide remplisse le capillaire du bouchon et qu’un ménisque se forme dans le réceptacle à l’extrémité supérieure du capillaire. Serrez la bague d’étalonnage du volume pour sécuriser sa position, assurant ainsi la cohérence du volume calibré pour les insertions consécutives. Pour commencer, remplissez les chambres avec le milieu respiratoire MiR05 Démarrez le logiciel DatLab. Sélectionnez le protocole approprié pour le test de fond instrumental. Réglez la vitesse de rotation de l’agitation à 550 tr/min, le volume de la chambre à 0,5 millilitre, l’intervalle d’enregistrement des données à deux secondes et la température expérimentale à 37 degrés Celsius. Exécutez le test de l’agitateur et l’étalonnage de l’air. Réglez le repère R1 sur le graphique de concentration d’oxygène en déplaçant le curseur tout en maintenant la touche Maj enfoncée. De temps en temps, effectuez des étalonnages d’oxygène zéro. Lors de l’étalonnage de l’air, préparez une solution mère de dithionite de sodium fraîche en dissolvant la poudre O2-Zero dans un tampon de phosphate de 50 millimolaires à une concentration de 2,5 millimolaires pour le SV. Une fois l’étalonnage de l’air terminé, fermez la chambre. Surveillez le signal d’oxygène pendant environ 60 à 120 minutes, ce qui permet à la concentration d’oxygène de diminuer de la saturation en air à environ 150 micromolaires. Placez quatre marques étiquetées J01 à J04 sur le graphique négatif de la pente d’oxygène. Si vous le souhaitez, à l’aide d’une seringue Hamilton, titrez la solution de dithionite de sodium pour ajuster la concentration d’oxygène à 100 micromolaires et réglez le repère J05. Pour calculer la pente de fond de l’oxygène instrumental dans DatLab, sélectionnez Pente de flux. Ensuite, ouvrez la fenêtre de correction de l’arrière-plan de l’oxygène et sélectionnez Fichier actif comme source des données d’arrière-plan de l’oxygène. Vérifiez que tous les repères J0 sont utilisés pour le calcul de la régression linéaire. Cliquez ensuite sur Appliquer pour la correction de l’arrière-plan de l’oxygène. Pour commencer, lavez les chambres Oroboros avec de l’eau déminéralisée et ajoutez du milieu MiR05 frais dans la chambre. Après le test de fond instrumental, ouvrez un nouvel onglet DatLab et sélectionnez le protocole SUIT-003 pour les expériences sur les plaquettes humaines. À l’aide de la vue d’ensemble du protocole DatLab qui s’affiche dans la barre latérale Protocole, sélectionnez les solutions mères de produits chimiques. Sélectionnez ensuite les seringues Hamilton en fonction des produits chimiques. Placez les seringues sur le support à seringues avec les étiquettes dans l’ordre selon le protocole SUIT. Pour le remplacement partiel du volume, calculez le volume V en équivalent au volume V retiré du volume réel dans la chambre ouverte, en tenant compte du volume mort capillaire. Retirez ensuite le bouchon complètement inséré et placez-le sur la grille. Retirer le volume V calculé de MiR05 de la chambre en fonction du type de cellule et de la concentration de la suspension de la cellule d’origine. Maintenant, pipetez un volume équivalent de la suspension de cellules mères avec une concentration cellulaire connue dans la chambre. En revanche, pour un remplacement complet du volume, siphonnez tout le support de la chambre. Ajoutez 0,54 millilitre du stock de mitochondries cardiaques isolées dans la chambre SV. Fermez la chambre et siphonnez tout excès de solution d’échantillon du réceptacle du bouchon. Pour démarrer un protocole de titrage d’inhibiteur de découpleur de substrat, ou SUIT, ouvrez la fenêtre Événement dans DatLab pour visualiser les volumes de titrage. À l’aide de la micro-seringue Hamilton, titrez les solutions mères de produits chimiques dans la chambre. Définissez ensuite l’événement dans DatLab. Prévoir la stabilisation du flux après le titrage. Pour l’analyse des données, placez une marque sur la partie représentative et stable de la parcelle. Le flux d’oxygène de fond à saturation de l’air était 3,9 fois plus élevé dans la chambre de 0,5 millilitre par rapport à la chambre de 2,0 millilitres, ce qui correspond à la différence théoriquement attendue de quatre fois dans le flux d’oxygène de fond spécifique au volume. La variabilité des flux de fond instrumentaux était presque identique dans les deux volumes de chambre. Les fréquences respiratoires des plaquettes vivantes, des fibroblastes perméabilisés et des mitochondries isolées étaient étroitement corrélées dans les deux types de chambres lorsque la correction de fond appropriée était appliquée. Le flux d’oxygène s’est stabilisé plus rapidement dans la chambre de deux millilitres que dans la chambre de 0,5 millilitre après la réoxygénation. La consommation résiduelle d’oxygène après l’inhibition du Complexe III était cohérente entre les deux chambres, alignée sur la limite de détection instrumentale.