Name: Respirométrie à haute résolution dans une chambre de petit volume (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Découvrez la respirométrie à haute résolution utilisant une chambre de 0,5 mL pour l'analyse de la fonction mitochondriale. Cette méthode réduit le volume d'échantillon nécessaire tout en maintenant une précision optimale pour la recherche biomédicale.

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Pour l’étude sur les plaquettes humaines, huit volontaires ont fourni un consentement éclairé écrit pour participer à l’étude, qui a été approuvé par l’Autorité suédoise d’examen éthique (n° 2013/181). Deux lignées cellulaires de fibroblastes de peau humaine provenant de nouveau-nés de sexe masculin ont été achetées à l’ATCC et utilisées conformément à l’approbation éthique du ministère de la Santé de la République tchèque (projet : AZV MZ CR NU22-07-00474). Les procédures impliquant des souris ont été menées conformément à la loi autrichienne sur l’expérimentation animale et à la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d’autres fins scientifiques (Tierversuchsgesetz 2012 ; la directive 2010/63/UE ; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). Le principe des 3R a été appliqué pour minimiser le nombre d’animaux de laboratoire.
1. Étalonnage du volume
<ol>
	<li>Montez les chambres de petit volume (sV) ou les chambres de volume classique (cV) sur l’Oroboros (Figure 1A,B ; Tableau 1).</li>
	<li>Allumez l’Oroboros et connectez-vous à DatLab.</li>
	<li>Séchez les chambres.</li>
	<li>Pipeter 0,54 mL de H2O dans leV s (volume expérimental effectif de 0,50 mL plus volume mort capillaire de 0,04 mL) ou 2,07 mL de H2O dansle V c (volume effectif de 2,00 mL plus volume mort capillaire de 0,07 mL). REMARQUE : Pour éviter toute perte de liquide entre le haut du cylindre en verre et le support de chambre en polyoxyméthylène (POM), insérez la pointe de la pipette suffisamment profondément pour toucher la paroi de la chambre en verre.</li>
	<li>Allumez les touillettes.</li>
	<li>Avant de fermer la chambre, humidifiez les joints toriques des bouchons tout en gardant leur capillaire sec. Desserrez les bagues d’étalonnage du volume et insérez les bouchons vers le bas jusqu’à ce que le liquide remplisse le capillaire du bouchon et qu’une petite goutte apparaisse dans le récipient à l’extrémité supérieure du capillaire (tableau 1).</li>
	<li>Serrez les bagues d’étalonnage du volume pour fixer leur position de sorte que le volume calibré soit obtenu par insertions consécutives des bouchons.</li>
</ol>
2. Réglage général d’Oroboros
<ol>
	<li>Démarrez le logiciel DatLab .</li>
	<li>Réglez la température expérimentale (37 °C) et la vitesse de rotation de l’agitation à 550 tr/min (9,2 Hz ou rotations par s) dans la chambre sV ou 750 tr/min (12,5 Hz) dans la chambre cV. Réglez l’intervalle d’échantillonnage des données à 2 s avec un lissage sur 80 s (40 points de données) dans les tests de fond instrumentaux O2 ou 40 s (20 points de données) pour la respirométrie. REMARQUE : Les barres d’agitation magnétiques (AlNiCo revêtues de difluorure de polyvinylidène [PVDF] ; Tableau 1) sont agités par un champ magnétique rotatif pulsé d’une intensité de champ de 3,5 mT au niveau de l’agitateur dans la chambre.</li>
	<li>Effectuer l’étalonnage de l’air28 dans MiR05 ou dans le même milieu d’incubation que celui utilisé dans les expériences ultérieures.</li>
	<li>Effectuez des étalonnages d’oxygène zéro de temps en temps, mais jamais immédiatement avant de commencer les expériences.<ol>
		<li>Préparez une solution mère de Na-dithionite fraîche en dissolvant la poudre O2-Zero dans un tampon phosphate de 50 mM (pH 8,0) à une concentration de 2,5 mM ou 10 mM pour les chambres s sV ou cV , respectivement.</li>
		<li>Titrer la Na-dithionite en excès pour obtenir le signal brut R0 ou courant nul [μA] à O2 concentration 0 μM14,28.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test de fond O2 instrumental
<ol>
	<li>Chambre sV
	<ol>
		<li>Après l’étalonnage de l’air, fermez la chambre. Surveiller le signal d’oxygène pendant environ 60 minutes jusqu’à ce que la concentration en O2 diminue de la saturation de l’air à environ 150 μM. Fixer quatre repères J°1 à J°4 sur le graphique « O2 pente négative ». REMARQUE : Effectuez ce test de fond instrumental O2 tous les jours avant de commencer une expérience.</li>
		<li>FACULTATIF : À l’aide d’une seringue Hamilton, titrer la Na-dithionite préparée selon l’étape 2.4.1 pour atteindreune concentration en O2 de 100 μM (figure 1C). REMARQUE : Dans un autre protocole, la na-dithionite est titrée dans la chambre à l’aide de la micropompe de titrage-injection (TIP2k ; Figure supplémentaire 1 et Figure supplémentaire 2) pour comparaison avec une méthode standard de détermination du fond instrumental O2 flux28.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chambre cV
	<ol>
		<li>Après le calibrage de l’air, fermez la chambre, attendez la stabilisation de la pente O2, et réglez le repère J°1 sur le tracé 'Pente O2 neg.'28. À l’aide d’une seringue Hamilton, titrer la Na-dithionite préparée selon l’étape 2.4.1. par paliers de 0,7 μL pour correspondre au régime d’oxygène de la chambre ss V et abaisser la concentration de O2 à 150 μM.</li>
		<li>Ajoutez une autre étape de titrage de Na-dithionite (environ 7 μL) pour abaisser la concentration d’O2 à 100 μM (Figure 1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analyse des données de fond de l’Instrumental O2<ol>
		<li>Calculez la pente de fond instrumentale O2 dans DatLab28. Sélectionnez Flux/Pente dans le menu supérieur.</li>
		<li>Ouvrez la fenêtre de correction d’arrière-plan O2. Sélectionnez Fichier actif comme source de l’arrière-plan O2 et sélectionnez les repères J° à utiliser pour le calcul de la régression linéaire. Appliquez la correction d’arrière-plan O2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2.jpg"> 
Figure 1 : Chambres de petit volume (sV) et de volume classique (cV) et test de fond instrumental O2. (A)Chambre c. B) Chambre cV. (C) Traces représentatives de pente négative et marques J°1, sV (0,5 mL ; vert) et cV (2,0 mL ; bleu). (D) Concentration d’oxygène correspondante et marques R1. Trois titrages manuels de Na-dithionite (environ 0,7 μL, 10 mM ; cV) et un titrage final de 7,0 μL de 2,5 mM et 10 mM dans les chambres s sV et cV, respectivement. Les pics causés par les titrages ont été éliminés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
4. Ajout d’échantillon aux chambres d’Oroboros
REMARQUE : L’échantillon peut être ajouté dans la chambre par deux méthodes : le remplacement partiel du volume (plaquettes et fibroblastes dans la présente étude) ou le remplacement complet du volume (mitochondries isolées dans la présente étude).
<ol>
	<li>Remplacement partiel du volume<ol>
		<li>Retirez le bouchon complètement inséré. Pipeter et jeter un volume Vde MiR05. Vout est de 60 à 70 μL pour les plaquettes et de 80 à 150 μL pour les fibroblastes, calculée en fonction des concentrations cellulaires dans la suspension cellulaire.</li>
		<li>Pour l’équivalent de Vout, pipeter le même volume VJ.i de suspension de cellules mères (avec la concentration cellulaire connue) dans la chambre (Figure 2).</li>
		<li>Calculez la concentration de la cellule expérimentale dans le volume réel V' (0,54 mL et 2,07 mL), supérieure au volume expérimental efficace V (0,5 mL et 2,0 mL). REMARQUE : Les concentrations de la suspension de la cellule mère et de la concentration de la cellule expérimentale doivent être planifiées de manière à obtenir des volumes de VJ.i = Vsortant qui soient compatibles avec une petite erreur de titrage. Dans les expériences avec les plaquettes, un prototype de bouchon a été utilisé pour la chambreV avec un volume mort capillaire de 0,05 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Remplacement complet du volume<ol>
		<li>Siphonnez tout le milieu de la chambre et remplacez-le par au moins 0,54 mL ou 2,07 mL de solution mère de mitochondries isolée à la concentration de l’échantillon expérimental dans les chambres s sV ou cV, respectivement.</li>
		<li>Fermez la chambre et siphonnez l’excès de solution mitochondriale du réceptacle du bouchon. REMARQUE : Le remplacement complet du volume exclut toute variabilité de la concentration mitochondriale qui peut être provoquée par le titrage dans la chambre fermée à travers le capillaire bouchon avec une seringue Hamilton. Cette dernière méthode s’applique aux échantillons de petit diamètre préparés dans des suspensions mères concentrées (p. ex., mitochondries isolées) ; cependant, il expose les cellules fragiles à des dommages potentiels des membranes plasmiques par les forces de cisaillement exercées dans l’aiguille de 51 mm de long de la seringue de Hamilton (0,41 mm de diamètre intérieur). Ceci est évité en retirant le bouchon et en pipetant l’échantillon dans la chambre par remplacement partiel ou complet du volume. Trois types de préparations mitochondriales ont été étudiés. Les préparations d’échantillons sont décrites dans le Dossier supplémentaire 1 1,26,29,30.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cellules vivantes : plaquettes humaines<ol>
		<li>Insérez les cryoflacons contenant les plaquettes dans un bain-marie à 37 °C et décongelez le contenu jusqu’à ce qu’il ne reste plus que de glace.</li>
		<li>Ouvrez les cryoflacons et ajoutez 1 ml de fluide préchauffé (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C) lentement par gouttes.</li>
		<li>Mélangez délicatement les plaquettes et transférez-les dans un tube à centrifuger de 50 ml avec un volume total de 10 ml de milieu préchauffé (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C). Centrifugeuse à 1000 g pendant 10 min à température ambiante (RT) à l’aide d’un rotor pivotant (accélération 6, frein 2).</li>
		<li>Remettre les plaquettes en suspension dans 0,25 mL de DPBS + 10 mM EGTA (RT) et les ajouter dans les chambres par remplacement partiel du volume jusqu’à une concentration cellulaire expérimentale initiale allant de 157 · 106 à 210 · 106 x·mL-1 dans la chambre de 0,5 mL et à partir de 164 · 106 à 220 · 106 x·mL-1 dans la chambre de 2,0 mL (voir31 pour plus de détails sur l’unité élémentaire x). REMARQUE : Un Oroboros était équipé des chambres sV et cV aux positions A et B, respectivement, utilisées en parallèle, tandis qu’un autre Oroboros était équipé des chambres sV et cV aux positions B et A, respectivement.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cellules perméabilisées : fibroblastes humains<ol>
		<li>Ajouter les cellules aux chambres Oroboros par remplacement partiel du volume jusqu’à une concentration nominale de cellules de 0,75 · 106 x·mL-1 dans les deux types de chambres et calculer la concentration réelle (étape 4.1.3). REMARQUE : Différents instruments Oroboros ont été utilisés en parallèle, chacun équipé des chambres s sV ou cV .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mitochondries isolées : cœur de souris<ol>
		<li>Ajoutez 15 μL de suspension mitochondriale à 5985 μL de milieu de respiration mitochondriale (MiR05), ce qui permet d’obtenir une concentration de protéines mitochondriales de base allant de 0,013 à 0,026 mg∙mL-1.</li>
		<li>Ajouter la suspension mitochondriale dans les chambres d’Oroboros par remplacement complet du volume. REMARQUE : Un Oroboros était équipé des chambres sV et cV dans les positions A et B, respectivement, utilisé en parallèle avec un autre Oroboros équipé des chambres s sV et cV dans les positions B et A, respectivement.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig02.jpg"> 
Figure 2 : Ajout de la suspension cellulaire par remplacement partiel du volume. (A) l’ajout dans la chambre de 0,5 mL sV et (B) la chambre de 2,0 mL cV. (1) Chambre fermée avec volumes de milieu respiratoire V et bouchon capillaire V stc rempli, pour la mesure du fond instrumental O2 flux JO2°. (2) Le bouchon a été retiré, Vstc a été drainé dans la chambre, ce qui a donné un volume total V' = V+Vstc. (3) Suppression partielle du milieu Vout = -V J.i. Un volume V''= V'+Vout reste dans la chambre. (4) Pipetage d’un sous-échantillon avec le volume V J.i de suspension cellulaire respirométrique dans la chambre, ce qui permet d’obtenir un volume total V# = V+Vstc de suspension cellulaire diluée. (5) Chambre fermée avec capillaire à bouchon rempli (volume mort Vstc) pour la mesure du flux O2 spécifique au volume J,V, O2 dans un volume expérimental V. Cette figure a été modifiée de la figure 2A dans Numération cellulaire et normalisation dans HRR41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
5. Protocoles SUIT
<ol>
	<li>Titrer les solutions mères des produits chimiques énumérés dans le tableau supplémentaire 1 dans les chambres à l’aide de microseringues Hamilton, en ajustant les volumes de titrage pour obtenir les mêmes concentrations expérimentales dans les chambres s sV et cV (voir les légendes des figures 6, 8 et 10).</li>
	<li>Sélectionnez le protocole SUIT-003_D018 32,33 (pour les plaquettes dans la présente étude).</li>
	<li>Sélectionnez les protocoles SUIT-001_D004 4,15,34,35 et SUIT-002_D007 4,15,35,36 (pour les fibroblastes dans la présente étude).</li>
	<li>Sélectionnez le protocole SUIT-002_D005 4,15,35,37 (pour les mitochondries isolées dans la présente étude).</li>
</ol>
6. Analyse des données SUIT
<ol>
	<li>Dans DatLab, définissez des repères pour définir des sections des tracés sélectionnés.</li>
	<li>Sélectionnez Flux/Pente dans le menu supérieur. Ouvrez la fenêtre Flux/Pente . Appliquer la correction du volume de titrage pour la dilution des échantillons en suspension par chaque titrage dans le protocole SUIT.</li>
	<li>Sélectionnez Marques dans le menu supérieur. Ouvrez Statistiques de repère pour afficher la médiane des points de données marqués corrigée de la ligne de base par soustraction de la consommation d’oxygène résiduelle (rox).</li>
	<li>Calculez l’ordonnée à l’origine et la pente entre les résultats appariés obtenus dans les chambres s sV et cV par analyse de régression inversée25,28 à l’aide d’une feuille de calcul.</li>
	<li>Comparez les fréquences respiratoires à l’état rox (flux minimum O2) dans les chambres s sV et cV par un test t de Student apparié à l’aide du logiciel jamovi 2.3.1338. REMARQUE : Étant donné que les deux chambres d’un instrument Oroboros sont fonctionnellement indépendantes (à l’exception de la température et des intervalles d’enregistrement DatLab), les mesures dans chaque chambre peuvent être considérées séparément, comme si vous utilisiez des instruments différents. Les résultats finaux peuvent être présentés sous forme de médianes ou de moyennes de plusieurs chambres avec des informations sur leur variabilité.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Exploration des volumes de chambre pour la respirométrie mitochondriale à haute résolution

<ol><li>Zdrazilova, L., Hansikova, H., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparable+respiratory+activity+in+attached+and+suspended+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparable respiratory activity in attached and suspended human fibroblasts.</a> PLoS ONE. 17 (3), e0264496(2022).</li>
<li>Schöpf, B., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32198407/">OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation.</a> Nat Commun. 11 (1), 1487(2020).</li>
<li>Meszaros, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+predictive+value+of+graft+viability+and+bioenergetics+testing+towards+the+outcome+in+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">The predictive value of graft viability and bioenergetics testing towards the outcome in liver transplantation.</a> Transplant International. 37, 12380(2024).</li>
<li>Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+fluorespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells%2C+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle%2C+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 1782, 31-70 (2018).</li>
<li>Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8746845/">Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).</li>
<li>Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14713113/">Oxygen Conformance of Cellular Respiration.</a> Hypoxia. Advances in Experimental Medicine and Biology. Roach, R. C., Wagner, P. D., Hackett, P. H. , Springer. Springer, Boston, MA. (2003).</li>
<li>Harrison, D. K., Fasching, M., Fontana-Ayoub, M., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+redox+states+and+respiratory+control+in+mouse+and+beef+heart+mitochondria+at+steady-state+levels+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome redox states and respiratory control in mouse and beef heart mitochondria at steady-state levels of hypoxia.</a> J Appl Physiol. 119 (10), 1210-1218 (2015).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Komlódi, T., Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Moore, A. L., Rich, P. R., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://www.bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/komlodi_2021_q">Coupling and pathway control of coenzyme Q redox state and respiration in isolated mitochondria.</a> Bioenerg Commun. 2021.3, (2021).</li>
<li>Suomalainen, A., Nunnari, J. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38788685/">Mitochondria at the crossroads of health and disease.</a> Cell. 187 (11), 2601-2627 (2024).</li>
<li>Cardoso, L. H. D., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39424161/">Fatty acid β-oxidation in brain mitochondria: Insights from high-resolution respirometry in mouse, rat and Drosophila brain, ischemia and aging models.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871, 167544(2025).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11718759/">Bioenergetics at low oxygen: dependence of respiration and phosphorylation on oxygen and adenosine diphosphate supply.</a> Respir Physiol. 128 (3), 277-297 (2001).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://books.google.at/books?id=JMlo1CuofE4C&dq=Gnaiger+E+(2008)+Polarographic+oxygen+sensors,+the+oxygraph+and+high-resolution+respirometry+to+assess+mitochondrial+function.+In:+Mitochondrial+dysfunction+in+drug-induced+toxicity+(Dykens+JA,+Will+Y,+eds)+John+Wiley+%26+Sons,+Inc,+Hoboken,+NJ:327-52.&lr=&source=gbs_navlinks_s">Polarographic Oxygen Sensors, the Oxygraph and High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function.</a> Mitochondrial dysfunction in drug-induced toxicity. Dykens, J. A., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 327-352 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/gnaiger_2020_mitopathways">Mitochondrial pathways and respiratory control. An Introduction to OXPHOS analysis.</a> Bioenerg Commun. 2020.2, (2020).</li>
<li>Diaz, E. C., Adams, S. H., Weber, J. L., Cotter, M., Børsheim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+LDL-C%2C+high+blood+pressure%2C+and+low+peak+VO%E2%82%82+associate+with+platelet+mitochondria+function+in+children-The+Arkansas+Active+Kids+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Elevated LDL-C, high blood pressure, and low peak VO₂ associate with platelet mitochondria function in children-The Arkansas Active Kids Study.</a> Front Mol Biosci. 10, 1136975(2023).</li>
<li>Ehinger, J. K., Morota, S., Hansson, M. J., Paul, G., Elmér, E. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25893255/">Mitochondrial dysfunction in blood cells from amyotrophic lateral sclerosis patients.</a> J Neurol. 262 (6), 1493-1503 (2015).</li>
<li>Heimler, S., et al. <a target="_blank" href="http://bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/heimler_2022">Platelet bioenergetics are associated with resting metabolic rate and exercise capacity in older adult women.</a> Bioenerg Commun. 2022.2, (2022).</li>
<li>Palacka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+mitochondrial+bioenergetics+reprogramming+in+patients+with+urothelial+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Platelet mitochondrial bioenergetics reprogramming in patients with urothelial carcinoma.</a> Int J Mol Sci. 23 (1), 388(2021).</li>
<li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+in+response+to+iron+deficiency+anemia%3A+Comparison+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration in response to iron deficiency anemia: Comparison of peripheral blood mononuclear cells and liver.</a> Metabolites. 12 (3), 270(2022).</li>
<li>JedIicka, J., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36647911/">Impact of aging on mitochondrial respiration in various organs.</a> Physiol Res. 71 (Suppl. 2), S227-S236 (2022).</li>
<li>Westerlund, E., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38439844/">Correlation of mitochondrial respiration in platelets, peripheral blood mononuclear cells and muscle fibers.</a> Heliyon. 10 (5), e26745(2024).</li>
<li>Hütter, E., Renner, K., Pfister, G., Stöckl, P., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+changes+in+respiration+and+oxidative+phosphorylation+in+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated changes in respiration and oxidative phosphorylation in primary human fibroblasts.</a> Biochem J. 380 (3), 919-928 (2004).</li>
<li>Yépez, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCR-Stats%3A+Robust+estimation+and+statistical+testing+of+mitochondrial+respiration+activities+using+Seahorse+XF+Analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer.</a> PLoS One. 13 (7), e0199938(2018).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/Gnaiger_2021_MitoFit_BCA">Bioenergetic cluster analysis - mitochondrial respiratory control in human fibroblasts.</a> MitoFit Preprints. 2021.8, (2021).</li>
<li>Palmer, J., Tandler, B., Hoppel, C. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/925018/">Biochemical properties of subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria isolated from rat cardiac muscle.</a> J Biol Chem. 252, 8731-8739 (1977).</li>
<li>Lai, N. M., Kummitha, C., Rosca, M. G., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol. 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Baglivo, E., Cardoso, L. H., Cecatto, C., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://www.bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/baglivo_2024">Statistical analysis of instrumental reproducibility as internal quality control in high-resolution respirometry.</a> Bioenerg Commun. 2022.8, (2022).</li>
<li>Mela, L., Seitz, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/007668797955006X?via%3Dihub">Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue.</a> Methods Enzymol. 55, 39-46 (1979).</li>
<li>Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/cardoso_2021_mgg">Magnesium Green for fluorometric measurement of ATP production does not interfere with mitochondrial respiration.</a> Bioenerg Commun. 2021.1, (2021).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26124/becprep.2025-0004">The elementary unit — count and numbers in the International System of Units.</a> BEC preprints. , (2025).</li>
<li>Vernerova, A., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34944675/">Mitochondrial respiration of platelets: Comparison of isolation methods.</a> Biomedicines. 9 (12), 1859(2021).</li>
<li>Oroboros Instruments SUIT-003 O2 ce-pce D018. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-003_O2_ce-pce_D018">https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-003_O2_ce-pce_D018</a> (2024).</li>
<li>Oroboros Instruments SUIT-001 O2 ce-pce D004. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-001_O2_ce-pce_D004">https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-001_O2_ce-pce_D004</a> (2024).</li>
<li>Timón-Gómez, A., et al. <a target="_blank" href="https://doi.org/10.1113/EP092792">Bioenergetic profiles and respiratory control in mitochondrial physiology: Precision analysis of oxidative phosphorylation.</a> Exp Physiol. , 1-33 (2025).</li>
<li>Oroboros Instruments SUIT-002 O2 ce-pce D007. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_ce-pce_D007">https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_ce-pce_D007</a> (2024).</li>
<li>Oroboros Instruments SUIT-002 O2 mt D005. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_mt_D005">https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_mt_D005</a> (2024).</li>
<li>The Jamovi Project jamovi (Version 2.3.13). , 
 <a target="_blank" href="https://www.jamovi.org/">https://www.jamovi.org/</a> (2024).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/images/3/3f/Gnaiger_1983_POS_preface.pdf">Preface: A biologist´s view.</a> Polarographic Oxygen Sensors. Aquatic and Physiological Applications. Gnaiger, E., Forstner, H. , Berlin, Heidelberg, New York. Springer. V-VII (1983).</li>
<li>Hütter, E., Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+oxygen+kinetics+of+cellular+respiration+and+linear+oxygen+dependence+of+antimycin+A+inhibited+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption.</a> Mol Biol Rep. 29 (1/2), 83-87 (2002).</li>
<li>Oroboros Instruments Cell count and normalization in HRR. , 
 <a target="_blank" href="https://wiki.oroboros.at/index.php/Cell_count_and_normalization_in_HRR">https://wiki.oroboros.at/index.php/Cell_count_and_normalization_in_HRR</a> (2020).</li>
<li>Williams, O., Sergent, S. R. <a target="_blank" href="https://europepmc.org/article/nbk/nbk557800">Histology Platelets</a>. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2022).</li>
<li>Donnelly, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.bioenergetics-communications.org/index.php/bec/article/view/donnelly_2022">The ABC of hypoxia - what is the norm.</a> Bioenerg Commun. 2022.12.V2, (2022).</li>
<li>Aguirre, E., Rodríguez-Juárez, F., Bellelli, A., Gnaiger, E., Cadenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+model+of+the+inhibition+of+respiration+by+endogenous+nitric+oxide+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetic model of the inhibition of respiration by endogenous nitric oxide in intact cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1797 (5), 557-565 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Anaconda3</td><td>Anaconda Software Distribution</td><td>https://www.anaconda.com/</td> <td>software</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Merck, Allemagne</td><td>117105</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotiques-antimycosiques 100x</td><td>Biosera, France</td><td>XC-A4110</td><td>ATTENTION H317 Peut provoquer une réaction allergique cutanée</td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>A8674</td><td>MISE EN GARDE H300 Mortel en cas d’ingestion, H400 danger aquatique à court terme (aigu)</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>&nbsp ; A 2383</td><td></td></tr><tr><td>BSA sans acides gras</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>A 6003</td><td>Albumine sérique bovine</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>C 4830</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>C2759</td><td>Cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone ATTENTION H301 + H311 + H331 Toxique en cas d’ingestion, de contact avec la peau ou d’inhalation</td></tr><tr><td>Comtesse Compteur automatisé de cellules&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific, États-Unis</td><td>AMQAX100</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>DatLab&nbsp ;</td><td>Oroboros Instruments, Autriche</td><td>Version 7.4</td><td>Logiciel pour l’acquisition et l’analyse de données</td></tr><tr><td>DatLab&nbsp ;</td><td>Oroboros Instruments, Autriche</td><td>Version 8.1 Logiciel</td><td>d’acquisition et d’analyse de données</td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Bio-Rad, États-Unis</td><td>5000112</td><td>Kit de dosage des protéines ; ATTENTION H314 Provoque de graves brûlures cutanées et lésions oculaires</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D5628</td><td>ATTENTION H301 Toxique en cas d’ingestion</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D 0632</td><td>ATTENTION H318 Provoque de graves lésions oculaires</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Pan Biotech, Allemagne</td><td>P04-05551</td><td>Dulbecco' Eagle modifié' s medium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D2650</td><td>diméthylsulfoxyde</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza Bioscience, Suisse</td><td>LONBE17-512F</td><td>Sans calcium Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>E 4378</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, États-Unis</td><td>A5256701</td><td>sérum fœtal bovin</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>&nbsp ; G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glutamate&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Glycérophosphate</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-215789</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3s Large</td><td>Thermo Fisher Scientific, États-Unis</td><td>HM3S</td><td>centrifugeuse</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 380R&nbsp ;</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Allemagne</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>centrifugeuse Imidazole</td><td>Honeywell Fluka, Autriche</td><td>56750</td><td>ATTENTION H302 Nocif en cas d’ingestion, H314 Provoque de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires, H360D Peut endommager l’enfant à naître</td></tr><tr><td>jamovi&nbsp ;</td><td>Le projet jamovi</td><td>Version 2.3.13</td><td>logiciel</td></tr><tr><td>K+-MES</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M 8250</td><td></td></tr><tr><td>Tube de leucosp ;</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Autriche</td><td>Tube à centrifuger Z642843-300EA</td><td>avec barrière en polyéthylène</td></tr><tr><td>Malate&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>M1000</td><td>ATTENTION H319 Provoque une grave irritation des yeux.</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>M 4125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp ;</td><td>Scharlau, Espagne</td><td>MA 0036</td><td></td></tr><tr><td>MiR05-Kit</td><td>Oroboros Instruments, Autriche</td><td>60101-01</td><td>milieu de respiration mitochondriale</td></tr><tr><td>Mixeur&nbsp ;</td><td>Swelab Instruments, Suède</td><td>440S</td><td>Table à bascule</td></tr><tr><td>Mr. Frosty Conteneur de congélation</td><td>Thermo Fisher Scientific, États-Unis</td><td>5100-0001</td><td>Conteneur de congélation</td></tr><tr><td>Oroboros</td><td>Oroboros Instruments, Autriche</td><td></td><td>le NextGen-O2k et le O2k sont désignés collectivement par le terme ' Oroboros</td></tr><tr><td>Chambre Oroboros cV</td><td>Oroboros Instruments, Autriche</td><td>23100-01</td><td>chambre à volume classique</td></tr><tr><td>Chambre Oroboros sV</td><td>Oroboros Instruments, Autriche</td><td>33100-01</td><td>chambre à petit volume</td></tr><tr><td>Oroboros TIP2k-Module</td><td>Oroboros Instruments, Autriche</td><td>11100-03</td><td>Titration-Injection</td></tr><tr><td>microPump O2-Zero Powder</td><td>Oroboros Instruments, Autriche</td><td>26600-02</td><td>&nbsp ; Na-dithionite ATTENTION H251 Auto-échauffement : peut prendre feu, H302 Nocif en cas d’ingestion, H319 Provoque une irritation oculaire grave</td></tr><tr><td>octanoylcarnitine</td><td>Biotrend - APExBIO Technology, Allemagne</td><td>B6371</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Phosphocréatine</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>P 7936</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>P2256</td><td>ATTENTION H317 Peut provoquer une réaction cutanée allergique</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>R8875</td><td>ATTENTION H300 Mortel en cas d’ingestion</td></tr><tr><td>Lignées cellulaires de fibroblastes cutanés&nbsp ;</td><td>&nbsp ; ATCC, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>S2002</td><td>ATTENTION H300 + H310 + H330 Mortel en cas d’ingestion, de contact avec la peau ou</td></tr><tr><td>d’inhalation Subtilisin A</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>P 5380</td><td>ATTENTION H318 - Provoque des lésions oculaires graves, H334 - Peut provoquer des symptômes d’allergie ou d’asthme ou des difficultés respiratoires en cas d’inhalation</td></tr><tr><td>Succinate</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>S 7903</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules sanguines Swelab Alfa&nbsp ;</td><td>Boule Diagnostics AB, Suède</td><td>1420041</td><td></td></tr><tr><td>Taurine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>T 0625</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite TM F200</td><td>Spectrophotomètre</td><td>Tecan, Suisse</td><td></td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>T3134</td><td>N,N,N',N'-Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride ATTENTION H315 Provoque une irritation cutanée, H319 Provoque une irritation oculaire grave</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T4799</td><td>ATTENTION H334 Peut provoquer des symptômes d’allergie ou d’asthme ou des difficultés respiratoires en cas d’inhalation</td></tr><tr><td>Vacuette</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Autriche</td><td>15452520</td><td></td></tr></tbody></table>

respirométrie à haute résolution dans une chambre de petit volume

High-Resolution Respirometry in a Small-Volume Chamber

Respirométrie à haute résolution dans une chambre de petit volume

Investigating respiratory fluxes is decisive for understanding the complex interplay between metabolic processes. Studies of cells and tissues with ...

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Haute résolution de respirométrie est utilisé pour déterminer la consommation d'oxygène des mitochondries. Cette technique est simple de déterminer les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale »(I-IV) de la fréquence respiratoire, la capacité maximale du système de transport d'électrons mitochondriale, et l'intégrité de la membrane externe mitochondriale.

Haute résolution Respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale dans perméabilisées et des cellules intactes

Ici, un échantillon de muscle quadriceps est prélevé sur un porc anesthésié et les mitochondries sont isolées par centrifugation différentielle. Ensuite, les fréquences respiratoires des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale I, II et IV sont déterminées à l’aide de la respirométrie à haute résolution.

Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution

Le but du présent protocole est de mesurer l’effet des changements induite par le glucose de la respiration mitochondriale en présence de composés naturels sur les cellules bêta intact 832/13 à l’aide de respirométrie haute résolution.

Haute résolution respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale des cellules bêta intactes en présence de composés naturels

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Pléthysmographie simplifiée du corps entier pour caractériser la fonction pulmonaire au cours de la mélioïdose respiratoire

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Dans cet article, vidéo, nous décrivons une nouvelle méthode permettant la construction de gradients odorant avec des géométries stable et contrôlable. Nous illustrer brièvement comment ces gradients peuvent être utilisées pour dépister les défauts olfactifs (anosmie complète et partielle) et d'étudier les caractéristiques plus subtiles du comportement chimiotaxie.

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Respirométrie à haute résolution dans une chambre de petit volume

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