Criblage in vitro à base de LED pour l’évaluation de molécules photoactivables dans l’inactivation photodynamique bactérienne

Mes recherches sont axées sur l’exploration de différentes molécules de la famille des composés de flavylium, naturels et synthétiques, avec un intérêt central pour l’étude de leur bioactivité dans le contexte de la photoprotection UV et l’évaluation de leur potentiel en tant que photosensibilisants pour les applications de thérapie photodynamique. Les résultats récents de notre groupe de recherche ont démontré les propriétés activées par la lumière des colorants de flavylium à base d’amines, les établissant comme une nouvelle classe prometteuse de photosensibilisants. Ces composés présentent un potentiel important d’exploration supplémentaire, ouvrant la voie à des applications innovantes dans le domaine.

En utilisant le système de microplaques et de panneaux lumineux à 96 puits, nous pouvons obtenir un criblage à haut débit de photosensibilisants dans un environnement contrôlé, simplifiant ainsi l’identification et la comparaison entre différents candidats à la thérapie photodynamique. Pour commencer, introduisez la bactérie Staphylococcus aureus sur une plaque de gélose Mueller-Hinton à partir de la culture stop. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 heures pour obtenir une culture fraîche.

Prélever deux à trois colonies fraîches de la plaque de gélose et les diluer dans six millilitres de PBS filtré stérile préchauffé à pH 7,4. Vortex l’inoculum à 1 200 tours par minute pendant trois à quatre cycles pour homogénéiser l’échantillon et prélever trois millilitres de l’inoculum homogénéisé dans une cuvette jetable. Après avoir mesuré la densité optique à 600 nanomètres, diluez l’échantillon pour correspondre à la densité optique de 0,1 à l’aide de PBS.

Préparez une solution mère du composé photosensibilisant dans un solvant approprié tel que le DMSO ou le PBS. Diluer la solution mère dans du PBS pour créer la solution de travail, en veillant à ce que les composants du milieu de culture bactérien n’interfèrent pas avec l’absorption de la lumière. Vortex la solution de travail pour assurer une homogénéisation complète.

Pour commencer, préparez la suspension de Staphylococcus aureus et la solution de travail du composé photosensibilisant. Préparez deux plaques distinctes à 96 puits, l’une destinée à l’exposition à la lumière et l’autre au contrôle de l’obscurité. Dans chaque plaque, distribuez 100 microlitres de solution photosensibilisante et de suspension bactérienne.

Mélangez les solutions 5 à 10 fois avec la pipette. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour permettre au photosensibilisateur d’interagir avec les cellules bactériennes. Après l’incubation, retirez les plaques de l’incubateur.

Gardez l’une des plaques à l’abri de l’exposition à la lumière comme contrôle de l’obscurité. Placez l’autre plaque à 96 puits au-dessus du panneau LED rectangulaire de 50 watts. Marquez les bords de la plaque sur la surface de la LED pour assurer un placement cohérent à travers les répétitions du protocole.

Exposez la plaque à la lumière LED pendant environ 15 minutes. Utiliser une autre plaque de 96 puits pour préparer des dilutions en série des échantillons, y compris les témoins, les puits non irradiés et les puits irradiés. Ajouter 180 microlitres de PBS dans chaque puits, en fonction du nombre d’échantillons.

Aliquote 20 microlitres de chaque puits dans les plaques irradiées et non irradiées dans la première colonne de la plaque remplie de PBS. À l’aide d’une micro-pipette multicanaux, effectuez une simple dilution en série du puits 1 à 6. Divisez une plaque de gélose en six sections égales, chaque section correspondant à l’une des dilutions.

Aliquote de 10 microlitres de chaque puits sur la section correspondante de la plaque de gélose. Incuber la plaque pendant 18 à 20 heures. Retirer la plaque de gélose de l’incubateur et identifier les zones propices au comptage des colonies.

À l’intérieur de chaque section de la plaque de tarière, comptez le nombre d’unités formant colonie. Le spectre de la lumière visible a montré trois pics distincts entre 400 et 700 nanomètres. Dans des conditions sombres, aucun des composés de flavylium testés n’a montré d’effets cytotoxiques.

En revanche, après une exposition à la lumière, les composés testés ont provoqué une diminution dose-dépendante de la viabilité de Staphylococcus aureus, avec des effets significatifs observés à des concentrations de 6 et 12 micromolaires.