Détection d’auto-anticorps anti-MDA5 à l’aide de cellules HeLa et immunocytochimie par microscopie optique

L’objectif principal de l’expérience suivante est d’utiliser l’immunocytochimie pour dépister les anticorps anti-MDA5. Cela se fait en utilisant les cellules HeLa, puis en transfectant la cellule HeLa avec la construction MDA5. En tant que telles, les cellules HeLa produiront des protéines MDA5 qui peuvent être attachées par des anticorps MDA5.

Après avoir inclus la cellule HeLa avec la construction MDA5, le réactif Triton est utilisé pour perméabiliser la membrane des cellules HeLa, ce qui permettrait aux anticorps anti-MDA5 de passer à travers. Après quoi, le sérum du patient qui contient les anticorps anti-MDA5 est ajouté. Les anticorps anti-MDA5 se fixeraient ensuite aux protéines MDA5 à l’intérieur des cellules HeLa.

Après cela, des anticorps secondaires, auxquels la peroxydase de raifort est attachée, sont déployés dans les cellules, les anticorps secondaires se fixent ensuite aux anticorps anti-MDA5. Enfin, le chromogène est ajouté aux cellules et oxydé en présence d’anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort, produisant une couleur visible au microscope optique. Un résultat positif montrerait quelque chose comme l’image ci-dessus.

Dans la démonstration vidéo d’aujourd’hui, nous abordons un domaine critique de la recherche médicale, la détection de l’anticorps du gène cinq associé à la différenciation anti-mélanome, également appelé anticorps anti-MDA5. Ces auto-anticorps jouent un rôle essentiel d’indicateur diagnostique simple pour les patients atteints de maladie pulmonaire interstitielle, en particulier ceux atteints d’une maladie pulmonaire interstitielle à progression rapide. La détection précoce et précise de l’auto-anticorps MDA5 est essentielle pour gérer efficacement cette maladie auto-immune grave.

Le principal avantage de la méthode que nous avons démontrée par rapport à la méthode dorée de dépistage des auto-anticorps anti-MDA5 est qu’elle pourrait être réalisée plus rapidement et permettre d’économiser du temps et des efforts par rapport au test d’immunovisite traditionnel radiomarqué. Cette efficacité accrue nous permet de traiter plus d’échantillons et de générer rapidement des résultats. De plus, il est crucial de noter que notre méthode offre non seulement une efficacité supérieure, mais aussi elle-même en termes de sécurité et de rentabilité par rapport au test d’immunoprécipitation transitionnelle.

Voyons maintenant comment c’est fait. Mon assistant de recherche, Teo Kai Fa, dirigera la procédure. Maintenez les cellules HeLa avec le milieu d’aigle modifié de Dulbecco contenant 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % d’antimycosique antibiotique à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2.

Passez les cellules tous les deux à trois jours, ou lorsque les cellules atteignent 90 à 100 % de confluence. Placez 70 000 cellules HeLa sur chaque puits d’une plaque de 24 puits. 24 heures avant la transfection, et filet les cellules, dont environ 90 % de confluence.

Diluez 500 nanogrammes de plasmine et 1,5 microlitre de réactif de transfection chacun dans un milieu sérique réduit de 25 microlitres. Ajoutez de l’ADN dilué, faites du réactif de transfection dilué dans un rapport de un à un. Bien mélanger et incuber pendant cinq minutes.

Ajoutez le mélange aux cellules assises la veille et agitez pour mélanger immédiatement le complexe lipidique de l’ADN. Confirmez que les cellules sont confluentes à 80 à 90 %. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un hémisphère humidifié à 5 % de CO2, 40 à quatre heures, et procéder à l’immunocytochimie.

Nous utilisons un facteur disponible dans le commerce. Vous trouverez plus d’informations dans le tableau des matériaux. Leur efficacité de transfection est de 50 %Le succès de la transfection et l’expression de la protéine cible peuvent être déterminés en transfectant les cellules avec du plasmide exprimant la protéine congelée et en conduisant du sang occidental pour visualiser l’expression de la protéine cible Après l’incubation, lavez les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer tout milieu restant.

Le lavage peut être effectué en secouant la plaque ou un agitateur orbital. Fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde dans PBS Attention. Le paraformaldéhyde est toxique.

Utilisez des directives de manipulation appropriées. Laissez les cellules pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, jetez le réactif fixateur.

Utilisez du PBS pour laver la cellule deux fois. Appliquez le réactif Triton, puis laissez reposer les cellules pendant 10 minutes à température ambiante. Nous avons utilisé Triton X 400 dans du PBS à une concentration de 0,3 %Après 10 minutes, jetez le réactif Triton.

Ajoutez du PBS pour laver les cellules une fois. L’étape suivante, effectuez le blocage avec 10 % de sérum bovin fœtal dans du PBS et laissez les cellules pendant une heure à température ambiante, retirez le réactif de blocage. Ensuite, ajoutez du PBS pour laver les cellules une fois.

Ajouter le plasma dilué du patient aux cellules. Assurez-vous de diluer le plasma du patient dans un rapport de 1 à 5 000 dilutions dans le PBS avant utilisation. Ajustez la dilution pour améliorer le signal ou réduire l’arrière-plan si nécessaire pour garantir des résultats impartiaux.

Le personnel a effectué le test et ne savait pas quels échantillons appartenaient aux patients et lesquels provenaient d’individus en bonne santé. Incuber un échantillon à quatre degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Après la période d’incubation, prélever l’échantillon du patient et laver les cellules trois fois avec du PBS.

Traiter les cellules avec du raifort dilué conjugué à la peroxydase de chèvre, des IgG anti-humaines dans un rapport de un à 250 dilution dans le PBS. Laissez les cellules pendant une heure à température ambiante. Une heure plus tard, jetez l’anticorps secondaire.

Rincer trois fois avec du PBS. Après avoir lavé les cellules, colorez les cellules avec une solution de travail DAB de 300 microlitres par puits. La solution de travail DAB est préparée avec le concentré de promotion DAB manquant et le diluant DAB suivant les instructions du fabricant.

Après avoir coloré la cellule pendant cinq minutes, retirez le colorant. Après avoir retiré le colorant, rincez avec de l’eau distillée ionisée et agitez pendant cinq minutes. Contre-colorez le noyau cellulaire avec de l’hématoxine diluée.

Nous utilisons l’hémotoxine dans un pli de dilution de 10. Attendez cinq minutes pour le processus de coloration. Après cinq minutes, jetez l’hémotoxine, puis lavez-la avec l’eau distillée analysée deux fois pendant cinq minutes chacune.

Dernière étape, observez les résultats de la coloration au microscope optique. Interprétons les résultats de nos tests d’immunocytochimie pour les auto-anticorps anti-MDA5. Un résultat positif.

Un vrai positif montre une forte coloration brune à l’intérieur de HeLa exprimant MDA5. Cela confirme la présence d’auto-anticorps anti-MDA5 dans l’échantillon du patient. Un résultat négatif.

Un résultat négatif montre que les cellules HeLa ne présentent pas de coloration brune, ce qui indique l’absence d’auto-anticorps anti-MDA5. Un résultat faussement positif. De manière critique, un faux positif montre une coloration brune étendue dans toutes les cellules, quelle que soit l’expression de MDA5.

Cette coloration non spécifique observée dans le but des maladies auto-immunes doit être distinguée d’un vrai positif pour éviter les erreurs de diagnostic. Notre méthode offre un moyen plus rapide, plus sûr et plus rentable de détecter les anticorps anti-MDA5 dans les organes. Cela a le potentiel d’avoir un impact significatif sur les résultats des patients dans la prise en charge de la pneumopathie interstitielle.

Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez appris comment effectuer la procédure d’immunocytochimie et comment identifier les résultats de test cliniquement pertinents.