Name: Analyse de l’activité des lymphocytes T humains dans un cadre de co-culture allogénique de cellules tumorales prétraitées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Découvrez l'analyse de l'activation des lymphocytes T humains en co-culture avec des cellules tumorales prétraitées par radiothérapie et inhibiteurs de kinases. Cette méthode permet d'évaluer la prolifération et l'expression des marqueurs de surface.

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<ol><li>Hiam-Galvez, K. J., Allen, B. M., Spitzer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+immunity+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Systemic immunity in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 21 (6), 345-359 (2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubes Cellstar de 15 mL</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Cellstar de 50 mL Plaque</td> de culture cellulaire <td>227261</td><td></td>6 puits <td>Greiner</td></tr><tr><td></td><td>Bio-One GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire de 96 puits stérile, fond F, avec couvercle</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>AZD0156</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S8375</td><td></td></tr><tr><td>Berzosertib (VE-822)</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S7102</td><td></td></tr><tr><td>CASYcups</td><td>OMNI Life Science GmbH & Co KG&nbsp ;</td><td></td><td></td>5651794</tr><tr><td>CASYton</td><td>OMNI Life Science GmbH & Co KG&nbsp ;</td><td></td><td></td>5651808</tr><tr><td>CD25a, PE-Dazzle594, biolégende IgG1 de souris</td><td></td><td>356126</td><td></td></tr><tr><td>CD28-UNLB</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>IM1376</td><td></td></tr><tr><td>CD3a,Krome Orange, Souris IgG1</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>B00068</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal CD3e</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>MA1-10176</td><td></td></tr><tr><td>CD4, APC, souris anti-souris IgG1</td><td>BD Pharmingen</td><td>555349</td><td></td></tr><tr><td>CD8 Microbilles, humain</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CD8a, PerCP-Cy5.5, souris IgG1</td><td>Biolegend</td><td>300924</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Deep Red</td><td>Dye Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>&nbsp ; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&acute ; s Aigle modifié&acute ; s Medium)</td><td>PAN-Biotech GmbH</td><td>P04-02500</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux DxFlex (avec chargeur automatique)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>C44326, C02846</td><td></td></tr><tr><td>EDTA sel disodique dihydraté</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior&nbsp ;</td><td>&nbsp ; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>S0615-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS supérieur&nbsp ;</td><td>&nbsp ; Merck KGaA (Sigma-Aldrich)&nbsp ;</td><td>S0615-100ML</td><td>Pour la production de FBS inactivé par la chaleur. Chauffer pendant 30 min à 56 &deg ; C avec mélange pour inactiver les protéines du complément.</td></tr><tr><td>Graph Pad Prism (numéro de version 9)</td><td>GraphPad</td> <td>Software-HLA-DR</td><td></td></tr><tr><td>, DP, DQ Anticorps anti-humain, APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-123-550</td><td></td></tr><tr><td>Kaluza (numéro de version 2.1)</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de L-Lysine</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>L5626-100G</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Solution Mère</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage améliorée par Neubauer</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG&nbsp ;</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>D8537-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>1514-122</td><td></td></tr><tr><td>ROTISep 1077</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>R1790</td><td></td></tr><tr><td>SepMate 50mL</td><td>tubes Stemcell Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>T6146-25G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td>15400054</tr></tbody></table>

analyse de l’activité des lymphocytes t humains dans un cadre de co-culture allogénique de cellules tumorales prétraitées

Analysis of Human T Cell Activity in an Allogeneic Co-Culture Setting of Pre-Treated Tumor Cells

Les cellules tumorales HSC4 dérivées d’un HNSCC ont été ensemencées et incubées pendant la nuit. Après 24 heures, les cellules ont été traitées avec un inhibiteur de kinase. Après 3 h, les deux premières doses de 5 Gy par fraction ont été appliquées. Après 24 heures, la deuxième dose a été appliquée et les cellules ont de nouveau été incubées pendant la nuit. En parallèle, 48 h avant le début de la co-culture, des lymphocytes T ont été isolés dans le sang d’un donneur sain. Tout d’abord, les PBMC ont été isolés à l’aide de tubes de centrifugation à gradient de densité et d’un milieu de séparation stérile. Les PBMC ont été comptés à l’aide d’une chambre de comptage cellulaire, et les lymphocytes T CD8+ ont été isolés à l’aide de la trousse d’isolement des lymphocytes T CD8+. Des lymphocytes T CD8+ isolés ont ensuite été colorés avec CFSE (1 μM) et comptés par la suite. Les lymphocytes T ont été ensemencés dans des plaques à puits pré-enrobées CD3/CD28 d’une densité de 1,5 x 106 cellules/3 mL. Après 48 h de stimulation, les lymphocytes T ont été récoltés, comptés et remis en suspension dans une densité de 10 000 cellules/10 μL. De plus, des puits représentatifs des cellules tumorales ensemencées ont été récoltés et comptés, et le milieu a été échangé contre tous les puits restants. Des lymphocytes T ont été ajoutés aux cellules tumorales dans un rapport de 1:1. La co-culture a été récoltée après 96 h, le surnageant a été stocké à -20 °C, et les cellules ont été colorées et mesurées par cytométrie en flux (Figure 1).
Les lymphocytes T ont été identifiés par l’exclusion de taille et la positivité des CD3/CD8. Le signal CFSE des cellules CD3+/CD8+ positives a montré la distribution des lymphocytes T non prolifératifs (signal CFSE élevé) et des sous-populations distinctes de lymphocytes T proliférants (perte d’intensité du signal CFSE). La proportion de lymphocytes T proliférants a été mesurée de manière exemplaire pour la lignée cellulaire HSC4 HNSCC (Figure 4A). Tous les lymphocytes T qui présentaient au moins une division ont été définis comme « prolifératifs ». Les lymphocytes T qui présentaient plus de 3 divisions ont été définis comme « hautement prolifératifs » (Figure 4B). Pour la lignée cellulaire HSC4 négative au VPH, une légère augmentation du taux de prolifération a été détectée lorsque les lymphocytes T ont été co-cultivés avec des cellules tumorales irradiées. La RT et l’inhibition de la RT plus l’ATR ont entraîné une augmentation significative de la prolifération consécutive des lymphocytes T par rapport aux co-cultures de cellules HSC4 traitées par RT plus inhibition de l’ATM avec des cellules T. En ce qui concerne la fraction « hautement proliférative » des lymphocytes T, le prétraitement des cellules HSC4 avec RT plus inhibition de l’ATR a été le plus efficace pour stimuler la prolifération des lymphocytes T (Figure 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig04v2.jpg"> 
Figure 4 : Prolifération des lymphocytes T colorés au CFSE pour l’analyse des changements de la prolifération des lymphocytes T dépendants du traitement de HSC4. (A) Proportion de lymphocytes T en prolifération après 96h de co-culture avec des cellules tumorales HSC4 négatives au VPH prétraitées. La prolifération des lymphocytes T était significativement plus faible après co-culture avec des cellules tumorales HSC4 traitées par RT+ATMi par rapport au traitement RT ou RT plus ATRi. (B) La RT des cellules tumorales HSC4 a induit une fraction plus élevée de cellules T hautement proliférantes (plus de trois divisions cellulaires. Après co-culture de cellules tumorales HSC4 prétraitées par RT+ATRi avec des lymphocytes T, le pourcentage de lymphocytes T hautement prolifératifs était le plus élevé. Les barres montrent les données de quatre expériences indépendantes avec les lymphocytes T de quatre donneurs sains indépendants (n = 4 ; Moyenne ± écart-type). (*p≤ 0,05, **p≤ 0,01, ***p≤ 0,001, ****p≤ 0,0001 ; la signification statistique a été testée en comparant toutes les conditions expérimentales à chacune d’elles à l’aide d’un Mann-Whitney-U bilatéral pour des données non distribuées normalement). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig04largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La perte de CFSE basée sur la prolifération peut être utilisée pour quantifier le taux de prolifération des lymphocytes T. De plus, plusieurs marqueurs de surface cellulaire sont décrits comme étant associés à l’activité des lymphocytes T, tels que CD25 et HLADR. Par conséquent, une analyse des CD25 et HLA-DR à la surface de tous les lymphocytes T CD3+ et CD8+ par cytométrie en flux a été effectuée (Figure 5). L’expression peut être quantifiée si des sous-populations distinctes à CD25élevé ou à HLA-DRélevé sont détectables et peuvent être discriminées en manipulant ces cellules hautement positives (Figure 3B). Si aucune sous-population distincte n’est détectable, l’intensité moyenne de fluorescence (IMF) de l’ensemble de la population peut être mesurée et les décalages de l’IMF en fonction de l’état peuvent être quantifiés (figure 3C).
De manière exemplaire, l’expression identifiée par l’IMF de CD25 et HLA-DR a été analysée après 96 h de co-culture avec des cellules tumorales HSC4 prétraitées (Figure 5). Après co-culture de lymphocytes T avec des cellules tumorales HSC4 traitées par RT, l’expression de CD25 sur les lymphocytes T a été fortement régulée à la baisse. Notamment, le prétraitement des cellules tumorales avec uniquement des ATMi a entraîné une diminution significative de l’expression de CD25 par rapport au prétraitement des ATRi. Dans le cadre combiné avec la RT, même si la RT a entraîné une diminution de l’expression de CD25 sur les lymphocytes T, la combinaison de la RT avec l’ATMi a entraîné une augmentation de l’expression de CD25 par rapport à la RT plus ATRi (Figure 5A). En ce qui concerne l’expression de HLA-DR sur les lymphocytes T, la RT a généralement conduit à une régulation positive de HLA-DR, mais encore une fois, en combinaison avec ATMi ou ATRi, un comportement différent a été observé (Figure 5B). Les lymphocytes T co-cultivés avec des cellules HSC4 qui ont été prétraités avec une combinaison de RT+ATRi ont augmenté l’expression de HLA-DR par rapport à RT seul ou RT+ATMi.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig05v2.jpg"> 
Figure 5 : Expression des marqueurs d’activation CD25 et HLA-DR à la surface des lymphocytes T après 96 h de co-culture avec des cellules tumorales HSC4 prétraitées. L’expression de CD25 et de HLA-DR a été analysée sur la base du décalage de l’IMF de l’ensemble de la population de lymphocytes T. La RT de HSC4 a entraîné une diminution de l’expression de CD25 sur les lymphocytes T et une augmentation de l’expression de HLA-DR. L’association de la RT et de l’ATMi a entraîné des profils d’expression significativement différents par rapport à la RT associée à l’ATRi. Les boîtes à moustaches montrent les données de quatre expériences indépendantes avec les lymphocytes T de quatre donneurs sains indépendants (n = 4 ; Moyenne ± écart-type). Les données ont été analysées en comparant toutes les conditions expérimentales les unes par rapport aux autres à l’aide d’un test de Mann-Whitney-U bilatéral pour des données non distribuées normalement (*p≤ 0,050). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig05largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Ces données indiquent de manière exemplaire que le traitement des cellules tumorales, dans ce cas des cellules HSC4 HNSCC, impacte l’immunogénicité des cellules tumorales. Cela peut être surveillé par la co-culture des cellules tumorales avec des cellules T pré-stimulées, ce qui conduit à un comportement de prolifération diversifié et à l’expression de marqueurs d’activation sur les cellules T humaines en fonction du régime de traitement des cellules tumorales appliqué.

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