Analyse de l’activité des lymphocytes T humains dans un cadre de co-culture allogénique de cellules tumorales prétraitées

Les cellules tumorales modifient le phénotype immunitaire pendant le traitement, ce qui pourrait avoir un impact sur le résultat et, par conséquent, l’objectif de notre recherche est d’étudier l’interaction entre les cellules T et les cellules tumorales afin de mieux comprendre ces interactions.

Améliorer la sensibilité radio, en particulier dans les tumeurs radiorésistantes, en associant la radiothérapie à des inhibiteurs de kinases. Le ciblage de la réponse aux dommages de l’ADN est actuellement un élément central des développements récents. Des modèles tridimensionnels de culture cellulaire et des modèles de co-culture sont actuellement établis dans le domaine de la radiobiologie afin d’accroître la comparabilité entre les données in vitro et in vivo.

[Narrateur] Pour commencer, obtenez des cellules tumorales HSC4 dans un volume approprié de milieu D10. Ensemencez au moins trois puits par condition, chacun contenant 15 000 cellules dans 200 microlitres de milieu dans 96 plaques de puits. Désignez une plaque pour le traitement de l’échantillon, y compris des puits pour le contrôle des cellules tumorales uniquement et des cellules T uniquement et des puits pour le comptage des cellules pour chaque traitement le jour de la co-culture. Le deuxième jour, traitez les cellules tumorales avec des inhibiteurs de kinases aux concentrations requises. Irradier une plaque après trois à quatre heures et la même après 24 heures d’incubation avec cinq gris pour l’irradiation hypofractionnée. Pour l’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC, transférez le sang mixte EDTA prélevé sur un donneur sain dans deux tubes de centrifugation de 50 millilitres. Remplissez les deux tubes de centrifugation jusqu’à 50 millilitres avec du PBS et 2 % de FBS. Ensuite, préparez six tubes de centrifugation avec des incrustations en plastique pour la séparation PBMC. Remplissez chacun avec 15 millilitres de milieu à gradient de densité froide. Recouvrir soigneusement le milieu à gradient de densité avec 12 à 15 millilitres de sang dilué. Centrifugez les tubes à 1 200 G pendant 10 minutes sans décélération. Après la centrifugation, transférez le surnageant dans quatre nouveaux tubes de centrifugation de 50 millilitres. Jetez les tubes usagés. Remplissez les nouveaux tubes de centrifugation jusqu’à 50 millilitres avec du PBS et 2 % de FBS et centrifugez à 120 G pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez soigneusement le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS contenant 2 % de FBS et combinez les deux pastilles en un seul tube de faucon. Remplissez à nouveau le tube de centrifugation à 50 millilitres avec du PBS contenant 2 % de FBS. Centrifugez les PBMC à 300 G pendant 10 minutes. Jetez soigneusement le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 80 microlitres de MACS plus un tampon pour 10 à la puissance sept cellules. Ajoutez 20 microlitres de microbilles CD8 pour 10 à la puissance de sept cellules et mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas. Incuber pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, lavez les cellules avec deux millilitres de MACS plus un tampon pour 10 à la puissance sept cellules. Centrifugez le tube à 300 G pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir jeté le surnageant, remettre les cellules en suspension dans 1000 microlitres de MACS plus tampon. Placez deux colonnes MS dans l’aimant et placez deux tubes de centrifugation de 15 millilitres en dessous. Équilibrez les colonnes avec 500 microlitres de MACS plus buffer. Chargez ensuite un volume égal de suspension cellulaire dans la colonne MS préparée. Rincez trois fois les colonnes avec 500 microlitres de MACS plus buffer. Étiquetez les cellules collectées finales comme étant à flux continu ou CD8 négatif et combinez-les dans un seul tube de centrifugation. Prenez ensuite un nouveau tube de centrifugation de 15 millilitres étiqueté lymphocytes T CD8 positifs. Rincez les deux colonnes contenant des lymphocytes T CD8 positifs marqués magnétiquement avec 1000 microlitres de MACS plus un tampon chacune. Avant de colorer les lymphocytes T, centrifugez-les à 300 G pendant cinq minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1000 microlitres de PBS. Centrifugez à nouveau la suspension à 300 G pendant cinq minutes. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 2000 microlitres d’une solution de coloration CFSE micromolaire. Incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, centrifugez les cellules colorées à 300 G pendant cinq minutes. Après avoir lavé les cellules avec du PBS, mettez-les en suspension dans un milieu de cellules T. Ensemencez les cellules dans la plaque à six puits revêtue de CD3 et CD28 et incubez. Le quatrième jour, récoltez les lymphocytes T et mettez-les en suspension dans leur milieu respectif. Ajoutez le nombre souhaité de cellules T dans les puits de cellules tumorales dans un rapport de un à un après avoir compté les puits désignés. Le septième jour, retirez la plaque de culture de l’incubateur pour quantifier la prolifération des lymphocytes T. Après avoir lavé les cellules, colorez-les avec les anticorps souhaités et effectuez une cytométrie en flux pour évaluer les cellules T. Excluez la population de doublets en fonction de l’aire de diffusion vers l’avant par rapport à la hauteur de diffusion vers l’avant pour obtenir des singlets. Tracez les singlets pour identifier les lymphocytes T en fonction de la zone de diffusion vers l’avant par rapport à la zone de diffusion latérale. Tracez l’expression de CD3 contre la zone de diffusion latérale pour discriminer les lymphocytes T. De plus, identifiez les lymphocytes T CD8 positifs après avoir tracé le signal CD8 contre la zone de diffusion latérale. Tous les lymphocytes T doivent exprimer CD3 et CD8. Tracez le signal CFSE de tous les lymphocytes T CD8 positifs sous forme d’histogramme. Une fois les étapes de contrôle terminées, sélectionnez les lymphocytes T CD8 positifs en entrée et analysez leur expression isotypique CD25 ou HLA-DR en traçant la fluorescence du marqueur de surface respectif par rapport à la zone de diffusion latérale. La proportion de lymphocytes T prolifératifs a augmenté lorsqu’ils étaient co-cultivés avec des cellules tumorales HSC4 irradiées. La radiothérapie ou l’inhibition de la RT et de la RT plus l’ATR a significativement augmenté la prolifération des lymphocytes T par rapport à l’inhibition de la RT plus l’ATM. Parmi les lymphocytes T hautement prolifératifs, l’inhibition de la RT et de l’ATR était la plus efficace pour stimuler la prolifération. L’expression de CD25 sur les lymphocytes T a été régulée à la baisse après co-culture avec des cellules tumorales HSC4 traitées par RT. Le prétraitement des cellules tumorales avec l’inhibiteur d’ATM seul a significativement diminué l’expression de CD25 par rapport à l’inhibiteur d’ATR. L’association de la RT et de l’inhibiteur de l’ATM a entraîné une augmentation de l’expression de CD25 par rapport à la RT associée à l’inhibiteur de l’ATR. L’expression de HLA-DR sur les lymphocytes T a généralement été régulée à la hausse par la RT. La co-culture avec des cellules HSC4 prétraitées avec un inhibiteur de la RT plus ATR a encore augmenté l’expression de HLA-DR par rapport à la RT seule ou à la RT plus inhibiteur de l’ATM.