Flux de travail d’imagerie et d’analyse à haut débit pour l’évaluation des phénotypes et des états de prolifération des cellules cutanées dans des échantillons de tissus

Ce protocole combine la méthode d’imagerie optique multiplexe, IBEX et le marquage EDU Click-iT pour détecter et catégoriser les types de cellules en division dans des processus hautement dynamiques, tels que la réparation de la peau. De plus, nous fournissons un nouveau pipeline de traitement d’imagerie open source pour l’acquisition et l’analyse d’images à haut débit. Enduire la plaque à 24 puits de 200 microlitres de gélatine chrome aluminium et incuber la plaque pendant 15 minutes sur un agitateur à bascule.

Retirez ensuite complètement la gélatine et séchez les puits enrobés pendant 60 minutes dans un four à 40 degrés. Coupez le tissu incrusté dans l’OCT à une épaisseur de 15 à 30 micromètres au niveau du cryostat et transférez-le rapidement dans un puits enduit contenant deux millilitres de PBS. Retirez soigneusement le PBS à l’aide d’une pipette d’un millilitre visant à maintenir la section de tissu centrée dans le puits.

Pour ce faire efficacement, aspirez lentement le PBS des bords du puits, en ajustant la position de la pipette au besoin pour éviter que le tissu ne se déplace. Séchez les sections de tissu pendant une heure dans un four à 37 degrés Celsius. Réhydratez-vous avec un millilitre de PBS pendant cinq minutes.

Perméabiliser le tissu avec 500 microlitres de 0,5 % Triton pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez brièvement le mouchoir deux fois avec du PBS et effectuez la réaction Click-iT pendant 30 minutes à température ambiante. Conservez les échantillons à l’abri de la lumière.

Lavez brièvement le mouchoir deux fois avec du PBS. Bloquer pendant une heure avec un tampon de blocage à température ambiante. Ajoutez les anticorps primaires pour le premier cycle.

Et incubez l’assiette pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Lavez trois fois avec du PBS. Effectuez la coloration secondaire des anticorps.

Pour le premier cycle, appliquez les anticorps secondaires pour les anticorps primaires non couplés avec une contre-coloration nucléaire. Incuber les échantillons à l’abri de la lumière pendant 60 minutes à température ambiante. Lavez le mouchoir trois fois avec un millilitre de PBS pendant cinq minutes à température ambiante.

Laissez environ 500 microlitres de PBS dans chaque puits et amenez la plaque au microscope. Dans le logiciel Meta Express, cliquez sur Filtrage, puis sur Configuration de l’acquisition. Cliquez sur le bouton Éjecter.

Nettoyez le bas de la plaque avec de l’éthanol à 70 % et insérez la plaque dans le microscope. Cliquez sur le bouton Load Plate (Plaque de charge). Dans l’onglet Objectif et appareil photo, sélectionnez le grossissement souhaité.

Comme mode d’acquisition, sélectionnez le mode confocal à fente de 51 micromètres. Dans l’onglet Plaque, sélectionnez le modèle de plaque. Rendez-vous dans l’onglet Visite des sites de plaques.

Sous Options de site, cliquez sur Nombre fixe de sites. Définissez le nombre de colonnes et de rangées de manière à ce qu’à peu près tout le puits soit couvert. Cliquez sur les sites de chevauchement 10 %Sélectionnez uniquement le premier puits pour l’acquisition en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le puits correspondant sur la carte de la plaque.

Allez dans l’onglet Autofocus d’acquisition. Pour une mise au point automatique de puits à puits, sélectionnez l’option de plaque et de fond de puits. Pour l’autofocus du site, sélectionnez l’option Tous les sites.

Allez dans l’onglet Longueurs d’onde et choisissez le nombre de colorants à imager dans le cycle actuel. Allez dans le premier onglet de longueur d’onde. Choisissez un laser avec décalage Z pour le positionnement Z, puis cliquez sur le bouton Calculer le décalage pour définir la hauteur d’imagerie correcte.

Choisissez l’image où l’échantillon est le mieux mis au point. Appuyez sur le bouton Focus. Une image nette du tissu est affichée.

Réglez la puissance d’éclairage sur 50 %Réglez l’intensité maximale cible sur 2000 et appuyez sur Auto Expose. Pour la série Z, choisissez la série Z et l’image de projection 2D, et pour la correction de l’ombrage, choisissez l’ombrage FL uniquement. Répétez les étapes pour d’autres longueurs d’onde, mais au lieu d’un laser avec décalage Z, choisissez Décalage Z à partir de W1 et choisissez zéro.

Allez à l’étape de la série Z et entrez la taille de pas souhaitée. Cliquez sur le bouton Focus. Faites glisser la flèche de position actuelle jusqu’à ce que le bas du tissu soit atteint et cliquez sur le bouton Définir B.

Faites glisser la flèche de position vers le haut du tissu et cliquez sur le bouton Définir T. Cliquez sur F2, Stop, appuyez à nouveau sur Start Live. Assurez-vous que l’étape se trouve au premier puits en faisant un clic gauche dessus.

Trouvez le bord du tissu et marquez tous les sites contenant du tissu pour l’acquisition en cliquant avec le bouton droit de la souris. Allez dans l’onglet Exécuter et tapez le nom de la plaque. Cliquez sur Enregistrer le protocole.

Configurez la région d’acquisition pour tous les autres puits. Exécutez Control, Journal, démarrez l’enregistrement, puis immédiatement Control, Journal, arrêtez l’enregistrement. Enregistrez le journal créé et ouvrez-le à nouveau via Contrôle, Journal, Modifier le journal.

Dans le panneau de gauche, allez dans Acquisition de plaques, chargez le protocole à partir du fichier et cliquez sur Acquisition de plaques pour ajouter ces étapes au journal. Double-cliquez sur Modifier l’acquisition de plaque, chargez le protocole à partir du fichier et choisissez le protocole enregistré pour le premier puits. Répétez les étapes pour chaque puits à acquérir, en veillant à toujours charger le protocole respectif.

Cliquez sur Exécuter le journal pour lancer l’acquisition. 30 minutes avant la fin du journal, commencez à préparer le réactif de blanchiment. Dissoudre 10 milligrammes de borohydrure de lithium dans 10 millilitres de H2O double distillé et passer à travers un filtre de 0,22 micromètre.

Laisser reposer 10 minutes. La solution devrait commencer à former des bulles. Pour assurer un blanchiment efficace, utilisez le réactif de blanchiment dans les quatre heures suivant la préparation.

Ajoutez la solution de blanchiment aux échantillons et incubez pendant 15 minutes tout en gardant les échantillons exposés à la lumière ambiante. De petites bulles devraient apparaître sur le tissu. Lavez les échantillons blanchis trois fois avec un millilitre de PBS pendant cinq minutes, chacune à température ambiante.

Ajoutez les anticorps primaires pour le cycle suivant et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. L’imagerie IBEX multiplexée combinée au marquage Click-iT EDU révèle différentes structures et types de cellules proliférantes dans la peau blessée. Le marquage EDU sur des échantillons cryoconservés s’avère similaire lors du marquage par immunofluorescence d’anticorps pour le KI-67 sur des coupes de tissus enrobées de paraffine, ainsi que du marquage des cellules avec du KI 67 à l’aide de la cytométrie en flux.

L’utilisation de ce protocole permet une détection précise de la prolifération cellulaire dans des processus biologiques complexes. De plus, le pipeline de traitement d’imagerie open source ne nécessite aucune expérience en programmation et génère des fichiers qui peuvent être traités avec des logiciels non commerciaux, tels que Fiji et quPath. De plus, ce protocole ne nécessite aucun équipement coûteux et peut donc être réalisé dans la plupart des contextes de recherche.