Transduction rétrovirale efficace et guidage compétitif pour l’étude de la localisation des lymphocytes T médiée par les RCPG dans divers microenvironnements tissulaires

Notre recherche explore comment les RCPG influencent le trafic et le positionnement des cellules immunitaires dans divers microenvironnements tissulaires. À l’aide de ce protocole et d’autres protocoles complémentaires, notre laboratoire a identifié un axe chimioattractant spécifique à un organe dans les tissus de la muqueuse non intestinale. Nous avons maintenant découvert comment les lymphocytes, qui abritent l’estomac, les poumons, la trachée et le tractus GU. Je présente une méthode efficace et améliorée pour tester comment les RCPG individuels affectent le mouvement des lymphocytes T in vivo. Nous avons mis au point un moyen fiable d’introduire ces récepteurs dans les lymphocytes T, qui permettent maintenant une comparaison directe côte à côte dans des essais de guidage compétitifs. Maintenant que nous savons comment les RCPG guident les lymphocytes T in vivo, les chercheurs peuvent mieux relier l’expression des récepteurs à la fonction immunitaire. Cela aiderait les chercheurs en immunologie fondamentale, ainsi que la recherche thérapeutique. Avec cette approche, nous pouvons maintenant nous demander comment des RCPG moins connus ou non caractérisés sont impliqués dans le guidage des lymphocytes T vers des tissus spécifiques. Nous pouvons apprendre comment la signalisation GPCR pourrait être affinée pour traiter le cancer ou l’auto-immunité. Nous pouvons aider les lymphocytes T à atteindre le bon endroit au bon moment pour les approches thérapeutiques.

[Narrateur] Pour commencer, le premier jour, enduire des plaques de culture tissulaire de 10 centimètres avec cinq millilitres de solution de poly-D-Lysine de 50 microgrammes par millilitre préparée dans de l’eau stérile. Incuber les plaques à température ambiante pendant 45 minutes, puis laver les plaques deux fois avec du PBS stérile sans calcium ni magnésium pour éviter tout résidu. Ensuite, détachez les cellules Plat-E à l’aide de deux millilitres de trypsine à 0,05 % et d’EDTA à 0,5 millimolaire à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Pour assurer la viabilité cellulaire à l’aide de l’essai d’exclusion du bleu de trypan, mélangez un volume égal de suspension cellulaire avec une solution de bleu de trypan. Ensuite, ensemencez 3 millions de cellules vivantes dans une boîte de Pétri de culture tissulaire de 10 centimètres avec un milieu Plat-E sans antibiotique. Le deuxième jour, remplacez le milieu sur les cultures cellulaires Plat-E par 6,5 millilitres de milieu sérique réduit. Préparez le mélange de transfection selon les instructions du fabricant. Pour chaque plaque, mélangez 45 microlitres de Lipofectamine 2000 avec 210 microlitres de milieu sérique réduit dans un tube et 15 microgrammes d’ADN avec 235 microlitres de milieu sérique réduit dans un autre tube. Combinez le contenu des tubes en pipetant trois à quatre fois et incubez pendant 20 minutes à température ambiante pour faciliter la formation de complexes. Maintenant, ajoutez le mélange goutte à goutte dans les assiettes et incubez pendant 16 heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, enduire des plaques à 24 puits pour l’activation des lymphocytes T avec des CD28 et CD3 anti-souris dans 375 microlitres par puits de PBS. Incuber les plaques pendant la nuit à quatre degrés Celsius ou pendant trois à quatre heures dans un incubateur réglé à quatre degrés Celsius. Le troisième jour, utilisez un piston de seringue pour écraser doucement les rates de souris isolées sur une passoire à mailles en nylon de 100 micromètres placée dans une plaque à six puits contenant un milieu RPMI. Transférez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire en maille de nylon de 40 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres pour obtenir une suspension à cellule unique. Centrifugez la solution à 450 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS sans calcium ni magnésium. Ensuite, effectuez la sélection négative magnétique à l’aide du kit d’isolement des lymphocytes T CD4 de la souris conformément aux instructions du fabricant. Comptez les lymphocytes T isolés à l’aide d’un compteur de cellules. Plaquez les cellules T dans les puits d’activation des cellules T enrobées à une densité de un à 1,5 million de cellules par puits dans un millilitre de milieu RPMI 10. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié pendant 24 à 48 heures. Le quatrième jour, prélevez environ 12 millilitres de surnageant viral à partir des plaques de 10 centimètres dans un tube conique. Remplacez le milieu dans les plaques de culture Plat-E par 10 millilitres de milieu Plat-E sans antibiotiques pour générer plus de surnageant viral pour une deuxième transduction le lendemain. Pour filtrer le surnageant viral collecté, passez-le à travers un filtre à seringue de 0,45 micromètre. Ajouter huit microgrammes par millilitre de Polybrene et une à 100 dilutions de tampon HEPES au surnageant filtré. Faites tourner la plaque de cellules T à 24 puits pendant sept minutes à 950 g. Ensuite, collectez et conservez soigneusement le surnageant sans déloger les lymphocytes T. Pour effectuer la spinfection, ajoutez un millilitre de surnageant viral dans chaque puits. Scellez les assiettes avec une pellicule plastique et faites-les tourner à 1 150 g pendant quatre heures à 32 degrés Celsius. Après la spinfection, remplacez soigneusement le milieu de chaque puits par le surnageant de cellules T précédemment enregistré. Le sixième jour, prélevez les lymphocytes T de la plaque dans un tube conique et centrifugez. Lavez le granulé avec du PBS contenant du calcium et du magnésium. Transférez les cellules dans une nouvelle plaque de culture contenant 130 unités par millilitre d’interleukine-2 de souris et 10 nanogrammes par millilitre d’interleukine-7 de souris. Incuber les cellules pendant au moins deux jours ou jusqu’à ce qu’elles atteignent le niveau d’expansion souhaité en fonction du nombre de cellules nécessaires à l’injection. Le huitième jour, centrifugez à 450 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour granuler les cellules. Ajoutez cinq millilitres d’Histopaque-1077 dans un tube de 15 millilitres. Remettez en suspension la pastille de lymphocytes T dans cinq millilitres de PBS contenant du calcium et du magnésium. Superposez soigneusement la suspension cellulaire sur cinq millilitres d’Histopaque-1077 dans le tube de centrifugation. Centrifugez l’échantillon à 400 à 500 g pendant 20 minutes à température ambiante, en vous assurant que la rupture ou l’accélération de la centrifugeuse est réglée sur 0. Après la centrifugation, observez la formation de couches cellulaires distinctes. Prélevez soigneusement la couche d’interface contenant les cellules souhaitées à l’aide d’une pipette, en évitant toute contamination par d’autres couches. Les lymphocytes T transduits par GPR25 ont montré une migration accrue vers hCXCL17 et mCXCL17 par rapport aux témoins transduits par Stuffer, validant l’expression fonctionnelle des récepteurs. GPR25 a transduit des cellules préférentiellement localisées dans les tissus de la muqueuse non intestinale, tels que le tractus génito-urinaire, l’estomac et la trachée, avec un enrichissement significatif observé à sept semaines, mais pas une semaine après l’injection. Des tests de guidage à court terme ont montré que GPR25 transduisait les lymphocytes T préférentiellement logés vers les organes riches en Cxcl17, tels que la trachée, l’estomac, la langue, la vésicule biliaire et la muqueuse utérine, alors qu’il ne s’accumulait pas chez les souris déficientes en Cxcl17. GPR25 a transduit des cellules principalement localisées dans les bronches, tandis que les cellules témoins étaient plus fréquemment trouvées près des veines.