Dosage modifié du nombre le plus probable pour quantifier la présence de Salmonella dans les produits de poulet crus et prêts à cuire

Nos recherches développent des technologies de détection, de quantification et de caractérisation rapides des agents pathogènes d’origine alimentaire, en mettant l’accent sur des méthodes sensibles qui peuvent améliorer la salubrité des aliments en identifiant une contamination dans des contextes réels. Les principaux défis incluent la réalisation d’une détection sensible rapide et de matrices complexes avec des solutions peu coûteuses mais évolutives. Nous abordons également les difficultés liées à la réduction des faux positifs et à l’amélioration de la compatibilité avec divers environnements de test.

Pour la sécurité alimentaire, cela signifie détecter avec précision les agents pathogènes à de faibles concentrations dans une variété de matrices alimentaires. Notre protocole aborde l’écart entre la détection de la prévalence et la quantification de la salmonelle afin de fournir des valeurs déterministes pour le niveau de contamination des produits alimentaires. Le processus est peu perturbateur car il intègre des tests validés utilisés dans les protocoles du FSIS et suffisamment souples pour s’adapter à d’autres agents pathogènes et matrices alimentaires.

Pour commencer, placez le poulet haché acquis au rayon de la viande fraîche des détaillants locaux sur une plate-forme de travail. Divisez aseptiquement la viande en échantillons de 25 grammes. Procurez-vous des produits de poulet prêts à cuisiner dans la section des aliments surgelés des détaillants locaux et divisez-les aseptiquement en échantillons de 25 grammes.

Striez le sérovar Typhimurium ATCC 14028 de salmonella enterica sur une plaque de tarière pour perfusion cerveau-cœur. Incuber l’assiette toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, inoculez 25 millilitres de bouillon d’infusion cerveau-cœur avec une colonie de salmonelle fraîchement cultivée.

Cultivez la culture en aérobie pendant la nuit à 37 degrés Celsius en secouant à 100 tr/min. Pour préparer une série de dilutions décuplées, transférez 0,5 millilitre de culture dans 4,5 millilitres d’eau peptidique tamponnée ou BPW et mélangez soigneusement. Transférez ensuite 0,5 millilitre de la dilution préparée dans 4,5 millilitres d’EPT pour chaque dilution ultérieure.

Ensuite, transférez aseptiquement 25 grammes de poulet haché irradié dans des sacs estomac stériles. Inoculer l’échantillon avec un millilitre de la concentration souhaitée de dilution de la culture. À l’aide d’un épandeur de cellules stériles, répartissez doucement l’inoculum uniformément sur la surface du poulet et laissez-le reposer à quatre degrés Celsius pendant une heure.

Après avoir incubé des échantillons de poulet haché irradié avec une culture de salmonelle pendant une heure, ajoutez 225 millilitres d’EPT à chaque échantillon pour obtenir le rapport échantillon/milieu souhaité. Homogénéiser les échantillons de poulet à l’aide de l’estomac à une vitesse normale pendant 120 secondes. À l’aide d’une pipette de 50 millilitres, retirez délicatement le liquide du côté filtré de l’estomac et divisez-le en deux flacons de centrifugation stériles.

Centrifuger les échantillons à 10 000 G pendant 10 minutes et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans trois millilitres d’EPT à l’aide d’une spatule stérile. Ajoutez 12 millilitres d’EPB à la pastille remise en suspension et mélangez soigneusement en remuant avec une spatule stérile.

Combinez le contenu des deux flacons de centrifugation en un seul flacon. Ajoutez trois millilitres de l’échantillon remis en suspension dans chaque puits de la première colonne du bloc de 48 puits pour créer huit répétitions. Pour préparer une série de dilutions décuplées sur les colonnes un à six à l’aide d’une pipette à huit canaux, ajoutez 0,3 millilitre de l’échantillon de chaque puits dans 2,7 millilitres de BPW dans la colonne suivante, en assurant un mélange complet.

Incuber les blocs pendant la nuit à 37 degrés Celsius en secouant à 100 tr/min. Le lendemain, à l’aide d’une pipette multicanaux, déposer sept microlitres de culture de chaque dilution sur des plaques de perfusion cerveau-cœur dans une grille de quatre par six. Laissez sécher les plaques pendant 10 minutes avant de les incuber à 37 degrés Celsius pendant 18 à 24 heures.

Après l’incubation, examinez les plaques de la vis sans fin, en indiquant qu’au moins une colonie est positive et qu’aucune croissance n’est négative. Entrez le numéro de dilution et le facteur de dilution dans une feuille de travail. Entrez le volume ou le poids approprié de l’échantillon.

Spécifiez ensuite le nombre de répétitions et entrez le nombre d’échantillons testés positifs. Cliquez sur calculer les résultats pour analyser les résultats positifs et négatifs annotés à l’aide de la méthode simple de résolution du maximum de probabilité. Pour commencer, mettez en place le bloc MPN de 48 puits pour la culture de salmonelles inoculée avec des échantillons de poulet.

Mélangez les cultures dans un bloc de 48 puits en pipetant plusieurs fois de haut en bas. Transférez 200 microlitres de chaque culture dans une plaque PCR de 96 puits. Fermez la plaque et centrifugez à 6 600 G pendant 10 minutes.

Retirez le surnageant et ajoutez 20 microlitres de réactif du kit d’extraction d’ADN à la pastille. Mélangez la pastille en pipetant de haut en bas. Encore une fois, scellez la plaque et chauffez-la à 99 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis refroidissez-la à 20 degrés Celsius.

Après centrifugation, utilisez deux microlitres de surnageant pour préparer le mélange QPCR selon le protocole établi. En utilisant les conditions suivantes, effectuez la PCR en temps réel. Après la PCR, exportez les résultats et considérez les puits dont les valeurs de seuil de cycle sont inférieures ou égales à 30 comme positifs et supérieurs à 30 comme négatifs.

Mélangez les cultures dans un bloc de 48 puits en pipetant plusieurs fois de haut en bas. Transférez 20 microlitres de chaque échantillon dans le tube de lyse fourni par le kit de détection moléculaire de salmonelle. Chauffez les échantillons à 100 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Ensuite, incubez les échantillons pendant 10 minutes à température ambiante. Transférez 20 microlitres de lysat de chaque tube de lyse dans un tube de réactif et chargez les tubes de réactif dans le support. Ajoutez le support avec les tubes de réactif à l’instrument du système de détection moléculaire.

Configurez les paramètres du logiciel pour le test du système de détection moléculaire. Exécutez le test et exportez le rapport pour analyse. Le rapport d’exécution MDS fournit des informations de sortie détaillées, positives ou négatives.