Culture et cueillette monoclonales microbiennes automatisées et à haut débit à l’aide du système omique de culture de gouttelettes de microlitres à cellule unique

Cette recherche explore les omiques de la culture microbienne, à l’aide d’une plateforme automatique, pour améliorer l’isolement, la culture et le criblage monoclonal des microbiens. L’objectif est d’améliorer la compréhension de l’intestin humain, du microbiome et de leurs applications. Les technologues qui font progresser la recherche sur le microbiome comprennent la chute de la microfluidique, les plateformes automatiques d’isolement et de criblage des contraintes, les algorithmes d’apprentissage automatique et les distributeurs monoclonaux pour les cultures omiques à haute tension et l’analyse du microbiome.

Le système à cellules moyennes améliore considérablement la microvue, l’isolement monoclonal et la coloration, générant près du double du nombre de clones par rapport aux méthodes traditionnelles, faisant ainsi progresser la capacité de recherche dans le mélange de cultures de microvues intestinales. Ce protocole répond au besoin d’une plateforme de criblage microbien à faible coût et à haut support, surmontant les limites des méthodes traditionnelles en termes d’efficacité et de capacité de score pour la recherche sur les mélanges de cultures. Notre laboratoire se concentrera davantage sur l’intégration de techniques supplémentaires de manipulation des gouttelettes, telles que la division et la fusion des gouttelettes, afin d’élargir la portée des applications technologiques.

Pour commencer, ouvrez la porte de la chambre de génération de gouttelettes et de culture de la cellule MISS. Retirez verticalement le couvercle de protection du micro-tube et de la puce microfluidique de génération de gouttelettes. À l’aide d’une seringue jetable, ajoutez 10 millilitres d’eau distillée stérile dans l’humidificateur à l’intérieur de la chambre et réinstallez le couvercle de protection.

Ouvrez l’emballage stérile de la puce microfluidique de génération de microtubes et de gouttelettes, et placez-le verticalement directement au-dessus de la chambre de culture. Puis sur l’interface du logiciel, cliquez sur installation. Lorsque la fenêtre contextuelle de confirmation apparaît, cliquez sur oui pour démarrer l’installation.

Sortez le dissolvant de bulles d’air et fixez-le à l’envers sur le placement du dissolvant de bulles d’air dans la chambre. Fixez le tube de sortie des gouttelettes de l’extracteur de bulles d’air à la vanne de serrage située en dessous. Guidez-le tout au long de l’ensemble jusqu’à la chambre de détection et de collecte des gouttelettes.

Après avoir ouvert la porte de la chambre, insérez verticalement le tube de détection dans la prise de détection. Assurez-vous que le tube de détection est complètement inséré. Serrez la vis fixant le tube de détection dans le sens des aiguilles d’une montre.

Après avoir confirmé l’insertion et la fixation complètes, fermez la porte de la chambre. Connectez chacun des 10 tubes en silicone de la puce microfluidique, étiquetés L1 à L10, à leurs vannes de serrage numérotées correspondantes. Ensuite, connectez le connecteur rapide de la puce microfluidique au port correspondant du système omique, en suivant les connexions appropriées.

Une fois l’installation de la puce terminée, une fenêtre contextuelle apparaît avec le message « La vanne de serrage du tube de gouttelettes » est ouverte. Cliquez sur OK lorsque l’installation de la puce de génération de microtubes et de gouttelettes est terminée. Après vous être assuré que tous les tubes sont correctement fixés à leurs vannes de serrage correspondantes, cliquez sur OK.

Avant d’effectuer l’initialisation, cliquez sur l’interface de réglage pour configurer les paramètres pertinents, tels que le mode sélectif, la température d’incubation, le temps d’incubation, la vitesse de l’agitateur, la longueur d’onde de détection OD et la longueur d’onde d’excitation et d’émission pour la détection de fluorescence. Accédez à l’interface d’accueil et cliquez sur initialiser. La fenêtre contextuelle de confirmation s’affiche, cliquez sur oui pour permettre au système IC d’effectuer une auto-vérification de ses composants, y compris la pompe d’injection, les paramètres de température, le test de décharge des déchets liquides, le module de dépistage et le module de détection des gouttelettes.

Une fois l’initialisation terminée, cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle. Pour préparer l’échantillon, prélevez l’échantillon microbien et effectuez une dilution en série avec le milieu correspondant pour obtenir une concentration d’environ 50 cellules par millilitre afin d’obtenir une suspension d’échantillon de 40 millilitres. Dévissez ensuite le bouchon de la bouteille d’échantillon et versez la suspension fécale diluée dans la bouteille à l’aide d’une barre d’agitation magnétique, jusqu’à la position d’ajout de l’échantillon.

Vissez le capuchon et serrez-le fermement. Insérez ensuite le connecteur rapide A dans le connecteur rapide B pour terminer le processus de chargement de l’échantillon. Après avoir placé le flacon d’échantillon dans la position désignée, séparez les connecteurs rapides A et B du flacon d’échantillon.

Connectez le connecteur rapide A de la bouteille d’échantillon au port O3 du système omique. Connectez le connecteur C3 de la puce microfluidique au connecteur rapide B et fermez la porte de la chambre. Sur l’interface d’accueil du logiciel, sélectionnez le nombre souhaité de tubes de gouttelettes à générer et cliquez sur produire pour démarrer la génération de gouttelettes à cellule unique.

Attendez la fenêtre contextuelle indiquant la fin de la création du droplet, puis cliquez sur OK. Fermez la pince sur les trois connecteurs et retirez le flacon d’échantillon. Sur l’interface d’accueil du logiciel, sélectionnez le même numéro de tube de gouttelettes que celui utilisé lors de la génération des gouttelettes.

Cliquez sur la culture. Confirmez le temps et la température de culture, et commencez le processus. Attendez la fenêtre contextuelle indiquant la fin de la culture des gouttelettes.

Appuyez sur le bouton UV du système omique pour allumer la lumière UV ultraviolette. Irradiez la chambre de détection et de collecte des gouttelettes pendant 30 minutes avant de l’éteindre. Dans un banc super propre, ouvrez les plaques à 96 puits utilisées pour la collecte des gouttelettes et empilez-les les unes sur les autres sans couvercles, en les numérotant séquentiellement de bas en haut.

Assurez-vous que la plaque supérieure est recouverte d’un couvercle. Ouvrez la porte de la chambre de détection et de collecte des gouttelettes et placez les plaques de puits dans les positions désignées. Retirez le couvercle de la plaque de puits supérieure, puis fermez la porte de la chambre.

Rallumez la lumière UV sur le système omique pendant 30 minutes pour effectuer une stérilisation secondaire. Ensuite, retirez le dissolvant de bulles d’air de sa position de placement. Dévissez le capuchon et retirez la vis en forme de papillon du bouchon.

Versez 200 millilitres d’huile d’élimination des bulles d’air dans le dissolvant de bulles d’air. Fixez bien le bouchon, puis fixez le dissolvant de bulles d’air à l’envers à l’endroit désigné. Sur l’interface d’accueil, sélectionnez le tube de gouttelettes pour le tri.

Cliquez sur Tri. Entrez le nombre de plaques de puits à collecter et lancez le processus de tri. Observez la zone d’affichage du processus pour des mesures en temps réel de la densité optique des gouttelettes ou des valeurs de fluorescence.

Analysez environ 20 à 30 gouttelettes pour vérifier la valeur de la DO. Si la plupart des gouttelettes ont une DO d’environ 0,2, réglez le seuil inférieur de DO à 0,5 et le seuil supérieur de DO à quatre. Le système recueillera automatiquement les gouttelettes dans cette plage dans les plaques de 96 puits.

Attendez la fenêtre contextuelle indiquant la fin du tri et de la collecte des gouttelettes, puis cliquez sur OK. Ouvrez la porte de la chambre de détection et de collecte des gouttelettes. Placez le couvercle de la plaque de puits sur la plaque de puits supérieure et retirez les plaques ensemble.

Cliquez sur Exporter les données pour enregistrer les données de signal de gouttelettes collectées. Cliquez sur carte thermique. Sélectionnez le fichier de données de collecte des gouttelettes et observez le diamètre extérieur affiché au format microplaque.

Visualisez ces valeurs de DO sous la forme d’une carte thermique où l’intensité des couleurs correspond à la distribution de DO dans les puits, fournissant une représentation claire et intuitive. La diversité des espèces du microbiote intestinal humain obtenue à partir du système omique, la méthode de la plaque solide et l’échantillon initial de selles ont été comparées au niveau de la famille. 34 familles microbiennes ont été enrichies à la fois par la méthode sur plaque solide et la méthode omique démontrée, le système omique enrichissant en outre quatre familles.

Le système omique a également enrichi efficacement certaines des familles de faible abondance. Au niveau du genre, les deux méthodes ont enrichi 74 genres microbiens, tandis que la méthode cellulaire MISS a enrichi 13 genres. De plus, deux genres initialement présents en faible abondance ont été efficacement enrichis grâce au système OMIC.

Ces résultats ont montré que la méthode de culture cellulaire MISS offrait de meilleures conditions de croissance pour les souches présentes en faibles proportions ou ayant de faibles performances de croissance dans la suspension microbienne d’origine.