Détection par fluorescence de l’activité des nucléases FEN1 et criblage d’inhibiteurs de petites molécules

Nous avons développé une méthode basée sur la fluorescence pour détecter les activités des nucléases de FEN1 et cribler les inhibiteurs à petites molécules, faisant ainsi progresser le diagnostic et la recherche thérapeutique ciblée.

Les défis actuels en matière d’expression comprennent la complexité et les problèmes de sécurité des méthodes conventionnelles, ainsi que le coût élevé et l’équipement spécialisé requis pour les techniques existantes basées sur la fluorescence.

Ce protocole a permis de remédier aux lacunes des méthodes radiologiques traditionnelles et des techniques de fluorescence à coût élevé, et offre une solution de détection plus sûre, efficace et facile à utiliser.

Notre laboratoire se concentrera sur l’optimisation d’une plateforme de criblage à haut débit afin d’explorer les applications et les mécanismes in vivo des inhibiteurs de FEN1 dans le traitement du cancer.

[Instructeur] Pour commencer, concevez des brins d’oligonucléotides d’ADN en fonction de l’activité de clivage spécifique de FEN1. Mélangez les oligonucléotides d’ADN simple brin dans un tampon de recuit. Ajoutez 10 microlitres de tampon de recuit et d’eau déminéralisée pour obtenir un volume total de 50 microlitres. Ensuite, chauffez le mélange réactionnel à 100 degrés Celsius pendant une minute dans un bain métallique. Transférez immédiatement le tube à 72 degrés Celsius et incubez pendant 10 minutes. Ensuite, éteignez la source de chaleur et laissez la solution refroidir progressivement à température ambiante pour former le substrat complet d’ADN double brin. Pour le test d’activité des nucléases FEN1, combinez d’abord deux microlitres du substrat d’ADN avec des nucléases FEN1 dans le tampon de réaction. Incuber le mélange réactionnel dans un bain métallique à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ajoutez 20 microlitres de tampon de terminaison 2X pour arrêter la réaction. Ensuite, chargez 20 microlitres de l’échantillon terminé sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 12 % pré-préparé. Électrophorèse le gel à 100 volts pendant 60 minutes. Une fois terminé, visualisez les résultats de l’électrophorèse sous un système d’imagerie par fluorescence. À l’aide d’une pipette, transférez deux microlitres de diméthylsulfoxyde dans un tube à microcentrifuger de 1,5 millilitre. Ajoutez deux microlitres de nucléase FEN1 et 10 microlitres de tampon de réaction 2X dans le tube et six microlitres d’eau déminéralisée. Mélangez bien la solution, puis incubez-la sur de la glace pendant 10 minutes. Après l’incubation, pipetez deux microlitres de substrat d’ADN pour atteindre un volume de réaction final de 20 microlitres. Ensuite, préparez une dilution de travail de l’inhibiteur de nucléase FEN1 FEN1-IN-4 en effectuant une dilution en série double à partir d’une solution mère d’une molaire dans du sulfoxyde de diméthyle. Pipetez deux microlitres de nucléase FEN1 et l’inhibiteur dilué de FEN1-IN-4 dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ensuite, pipetez 10 microlitres de tampon de réaction 2X et quatre microlitres d’eau déminéralisée. Mélangez délicatement et incubez le mélange sur de la glace pendant 10 minutes. Maintenant, ajoutez deux microlitres de substrat d’ADN dans le tube pour porter le volume final à 20 microlitres. Incuber le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius dans un bain métallique pendant 15 minutes. Ensuite, terminez la réaction en ajoutant 20 microlitres de tampon de terminaison. Une bande protéique claire d’environ 45 kilodaltons a confirmé la purification réussie de la nucléase FEN1 à partir de l’expression induite. Le substrat d’ADN double brin marqué à la fluorescéine est apparu à 80 kilodaltons, confirmant une synthèse réussie par rapport au substrat simple brin à 59 kilodaltons. La nucléase FEN1 a clivé le substrat d’ADN double brin de 80 nucléotides de manière dose-dépendante, avec un clivage complet observé à 0,5 microgramme par microlitre. Le composé FEN1-IN-4 a inhibé de manière significative le clivage du substrat d’ADN double brin par FEN1, comme le montre la rétention de la bande de 80 nucléotides. FEN1-IN-4 a réduit l’activité des nucléases de FEN1 d’une manière dépendante de la concentration, avec une concentration inhibitrice de moitié maximale de 14,03 micromolaires.