Écran CRISPR à l’échelle du génome pour dévoiler les gènes radiosensibles et radiorésistants

Cette recherche se concentre sur l’écran CRISPR à l’échelle du génome et la radiothérapie. Nous fournissons un protocole pour visualiser les gènes radiosensibles et radiorésistants à l’aide d’un criblage CRISPR à l’échelle du génome dans les cellules cancéreuses du poumon après irradiation. Les défis expérimentaux actuels comprennent les effets hors cible, qui sont causés par la grande complexité du génome et les difficultés potentielles à explorer les mécanismes sous-jacents. Par rapport aux méthodes de criblage traditionnelles, CRISPR permet une modification génétique permanente et fait preuve d’une précision supérieure, ce qui le rend particulièrement précieux dans la recherche génomique fonctionnelle et la découverte de cibles. À l’avenir, notre équipe se concentrera sur l’étude de l’écran CRISPR in vivo pour résoudre les problèmes que cette recherche a laissés derrière elle, et nous nous engageons à optimiser la technologie CRISPR.

[Narrateur] Pour commencer, ajustez la densité des cellules adhérentes à cinq fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre. À l’aide d’une pipette, répartissez deux millilitres de suspension cellulaire dans chaque boîte de culture de 3,5 centimètres pour une radiothérapie à différentes doses. Placez les plats dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et incubez toute la nuit. Numérotez chaque boîte de culture de 3,5 centimètres de un à cinq, à l’aide d’un marqueur. À l’aide d’une source de rayonnement, administrez des doses de rayonnement de 2, 4, 6 et 8 gray, respectivement, à des paraboles deux à cinq. Ajustez la densité des cellules irradiées à une fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre. Grainez 10 microlitres par puits, ce qui correspond à 1000 cellules par 100 microlitres dans des plaques à six puits avec trois répétitions par dose de rayonnement. Ensuite, ensemencez 30 microlitres par puits, ce qui correspond à 3000 cellules par 100 microlitres dans des plaques de 96 puits avec cinq répétitions par dose de rayonnement. Maintenant, mélangez le réactif CCK-8 avec le milieu RPMI 1640 sans FBS dans un rapport de un à neuf. Ajoutez le mélange dans l’assiette à 96 puits et incubez l’assiette dans l’obscurité pendant une heure. Ensuite, utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer la densité optique à 450 nanomètres. Pour commencer le processus d’infection, établissez un gradient de concentration logarithmique pour le lentivirus de zéro à 800 unités par millilitre. Ajoutez le volume correspondant de lentivirus à deux microlitres de polybrène par plat et laissez-le s’équilibrer à température ambiante pendant cinq minutes. Versez lentement le mélange de polybrène lentiviral dans chaque puits. Ajustez la densité cellulaire parentale à trois fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre et injectez un millilitre dans chaque puits d’une plaque à 12 puits. Ajouter la puromycine dans un gradient de concentration dans les puits. Après 72 heures d’infection, remplacez le milieu dans chaque puits par un milieu complet contenant la concentration minimale de puromycine pour la destruction cellulaire. Calculez la multiplicité de l’infection pour chaque puits en fonction des cellules survivantes. Ajustez la densité des cellules adhérentes à une fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre. Ajoutez du lentivirus à une multiplicité d’infection égale à 0,3 à 30 microlitres par boîte de polybrène et laissez-le s’équilibrer à température ambiante pendant cinq minutes. Versez lentement le mélange de lentivirus et de polybrène dans la boîte de culture de 15 centimètres. Mélangez bien et incubez-le toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le deuxième jour après l’infection, aspirez le milieu de la boîte de culture et remplacez-le par 15 millilitres de milieu complet RPMI 1640 contenant 10 % de FBS. Répétez le même traitement pour les cellules parentales non infectées en tant que témoin négatif et poursuivez la culture pendant 72 heures. Maintenant, digérez les cellules d’une boîte de culture de 15 centimètres en utilisant 0,25 % de trypsine. Remettez en suspension les cellules dans le milieu complet RPMI 1640 avec 10 % de PBS et comptez le nombre de cellules. Après avoir extrait l’ADN génomique du jour zéro, utilisez un spectrophotomètre UV NanoDrop pour mesurer la concentration et la pureté de l’ADN. Administrer une dose appropriée de rayonnement aux cellules du groupe de traitement et laisser les cellules du groupe témoin non traitées se propager normalement. Après 14 jours de traitement, digérez les cellules du groupe de traitement et du groupe témoin en utilisant 0,25 % de trypsine. Remettre les cellules en suspension dans le milieu complet RPMI 1640 avec 10 % de FBS. Centrifugez les cellules à 300 G pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Remettez le granulé en suspension dans un millilitre de PBS. Après avoir répété l’étape de centrifugation, extrayez l’ADN génomique du jour 14 de la pastille et déterminez la concentration d’ADN. Ensuite, préparez les apprêts requis et diluez-les à 10 micromolaires. Après avoir ajouté les composants pour mettre en place un système de réaction de 20 microlitres, centrifugez brièvement le tube à 300 G pendant cinq secondes. Pour l’électrophorèse sur gel d’agarose, préparez le gel, retirez-en le peigne et remplissez le réservoir d’électrophorèse avec suffisamment de tampon pour couvrir le gel. Ajoutez un tampon de chargement à l’échantillon d’ADN et mélangez bien. Enfin, chargez le mélange dans les puits et commencez l’électrophorèse La formation de colonies après 14 jours a révélé que l’exposition à deux Gray de rayonnement réduisait considérablement le nombre de colonies survivantes par rapport à zéro Gray. L’essai CCKA a montré une baisse substantielle de la viabilité cellulaire à deux Gray, avec une diminution supplémentaire à des doses de rayonnement plus élevées. Le traitement avec des concentrations croissantes de puromycine pendant 72 heures a montré qu’une micromolaire était la concentration minimale requise pour éliminer les cellules A549. La validation par PCR a montré des bandes distinctes à 231 paires de bases, confirmant la longueur attendue des séquences d’ARNsg dans la banque CRISPR. L’analyse du séquençage a révélé qu’environ 60 % des lectures ont été cartographiées avec succès sur le génome de référence. Le nombre de lectures d’ARNsg a suivi une distribution de Poisson, ce qui correspond aux attentes théoriques pour un dépistage à l’échelle du génome. L’analyse de l’ACP et de la carte thermique a montré une grande variabilité entre les groupes et une faible variation entre les groupes, validant la cohérence expérimentale. L’analyse de l’ontologie génétique a identifié la réponse aux dommages de l’ADN comme une voie enrichie supérieure parmi les 15 premiers résultats.