Une procédure de chirurgie Craniotomie pour l'imagerie cérébrale chronique

Les techniques d’imagerie prennent de plus en plus d’importance dans l’étude du fonctionnement du cerveau. Parmi eux, la microscopie laser à deux photons est apparue comme une méthode extrêmement utile car elle permet l’étude du cerveau anta vivant et avec des préparations appropriées. Cette technique permet l’observation chronique d’une même zone corticale de quelques minutes à plusieurs mois.

Dans cette vidéo, nous montrons une préparation pour l’imagerie chronique in vivo du cerveau à l’aide de deux photomicroscopies. Le Dr Carl Voda, chercheur à l’Institut médical Howard Hughes à Janelia Farm, a d’abord été le pionnier de la préparation de la fenêtre crânienne que nous allons démontrer aujourd’hui. Salut et Ricardo doit du laboratoire de Carlos Porter Cayo au Département de neurologie de l’Université de Californie à Los Angeles.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer la procédure de création d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie chronique in vivo. Cette préparation est très utile car elle permet d’imager profondément à l’intérieur du cerveau à l’aide d’un microscope laser à photons. Alors, commençons.

Avant de commencer la chirurgie, les souris sont anesthésiées avec du fluor. 4 % pour l’induction, un point demi à 2 % pour la chirurgie, en utilisant des procédures approuvées I-A-C-U-C, il est important d’utiliser des pincements de la queue et / ou des orteils afin de s’assurer que l’animal est complètement sédatif. À l’aide d’une tondeuse à rongeurs, les poils de la nuque jusqu’aux yeux sont rasés.

Après le rasage, la souris est placée sur un cadre stéréotaxique, reposant sur une couverture à recirculation d’eau réglée À 37 degrés Celsius, la tête est fermement fixée à l’aide de barres d’oreille. Une pommade oculaire est ensuite appliquée afin d’éviter que l’œil de l’animal ne se dessèche. Ensuite, la dexaméthasone, 0,2 milligramme par kilogramme et le carprofène, 5 milligrammes par kilogramme, sont administrés par voie sous-cutanée.

Afin de prévenir respectivement un gonflement du cerveau et/ou une réponse inflammatoire. Avant de commencer l’opération, assurez-vous de stériliser la zone d’opération en essuyant la peau avec trois écouvillons alternés d’alcool à 70 % et de bétadine. Tous les instruments chirurgicaux ont été pré-stérilisés à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre à l’aide de ciseaux pulvérisés avec de l’éthanol.

La peau sur le dessus du crâne est enlevée, en commençant par une coupe horizontale le long de la base de la tête, suivie de deux coupes dans le sens rostral, atteignant presque les paupières. Puis deux coupes obliques qui convergent vers la ligne médiane. À ce stade, une goutte de solution de lidocaïne et d’épinéphrine est appliquée sur le périoste pour éviter des saignements excessifs ou des douleurs avec un scalpel, le périoste est rétracté vers les bords du crâne.

La musculature de l’arrière du cou est également légèrement rétractée. Toute la zone exposée du crâne est ensuite grattée doucement avec un scalpel pour créer une surface sèche. Ceci est très important car cela permettra à la colle de mieux adhérer lorsqu’elle sera appliquée plus tard.

Une fois qu’un site d’imagerie a été choisi, on est prêt à créer la fenêtre crânienne en premier. Un cercle d’environ quatre millimètres de diamètre est dessiné doucement à l’aide d’une perceuse dentaire pneumatique. Après un léger forage, une solution de lidocaïne et d’épinéphrine est appliquée à nouveau sur la surface du crâne.

Le forage est arrêté lorsqu’il reste une très fine couche d’os, généralement un nez. Ce stade est atteint en poussant doucement sur le centre de leur craniotomie pour sentir comment elle cède sous une goutte de sérum physiologique et en profitant de la trabécule osseuse. Une structure spongieuse de l’os.

La craniotomie est soulevée du crâne à l’aide d’une pince à pointe très fine. La solution saline est importante car elle aidera à soulever le crâne et à prévenir les saignements de la dure-mère. Ensuite, une mousse de gel préalablement imbibée de solution saline est appliquée sur la dure-mère afin d’arrêter tout petit saignement qui se produit parfois lorsque le crâne est retiré.

Après avoir séché la surface de la dure-mère et s’être assuré qu’il n’y a pas de saignement, une lamelle en verre stérile de cinq millimètres est délicatement posée sur la matière dure. Une goutte de colle à base de cyanoacrylate est appliquée sur l’hémisphère opposé du crâne. À l’aide d’une aiguille, la colle est appliquée doucement tout autour de la fenêtre en prenant soin de ne pas la mettre sous la vitre.

La colle peut maintenant être appliquée en fine couche sur toute la surface du crâne. Une fois que la colle a séché, l’acrylique dentaire est mélangé et appliqué sur toute la surface du crâne, en recouvrant également un petit bord de la lamelle pour la fixer. Après avoir fixé la lamelle, un petit puits est fait autour de la fenêtre avec de l’acrylique dentaire.

Une barre de titane est également incrustée dans l’acrylique dentaire. Cette barre sera ensuite utilisée pour fixer solidement la souris sur la platine du microscope. Pour l’imagerie, il est important de s’assurer que la barre est de niveau de manière à ce qu’elle soit parallèle à une fenêtre crânienne.

Placer un morceau de papier sous la barre peut permettre à la barre de rester à niveau pendant que l’acrylique durcit, l’acrylique dentaire est laissé durcir ou durcir pendant 10 minutes, après quoi la barre de titane a été fixée en place. L’animal est ensuite placé dans une cage chaude jusqu’à ce qu’il se rétablisse. Après la récupération de l’anesthésie, l’animal peut être imagé le même jour.

Cette vidéo montre une pile de 160 images prises à des intervalles de cinq microns avec notre microscope à deux photons personnalisé à travers une fenêtre crânienne placée sur le cortex somatosensoriel d’une souris GFPM âgée de trois mois. Cette lignée transgénique de souris exprime la GFP dans un petit sous-ensemble de neurones parmaux. Dans la couche cinq et la couche deux trois, l’image a été prise avec un objectif d’immersion dans l’eau 40x avec une ouverture numérique de 0,8 en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 910 nanomètres.

Dans les images les plus superficielles, il est facile de reconnaître les arborescences dendritiques des dendrites apicales des cellules paramétalliques. La touffe apicale des dendrites de chaque neurone converge vers une seule grande dendrite apicale. Des dendrites obliques plus petites peuvent également être observées en provenance de cette dendrite apicale principale, les axones traversant le champ de vision sont également évidents.

Il s’agit d’une pile de 12 images prenant tous les un micron et demi en utilisant le même objectif 40x à un grossissement plus élevé, une dendrite superficielle est montrée à une résolution élevée suffisante pour résoudre les épines dendritiques individuelles. Nous venons de vous montrer comment effectuer une préparation de fenêtre crânienne pour l’imagerie chronique du cerveau à l’aide de la photomicroscopie. Il s’agit d’une méthode extrêmement puissante pour l’étude du cerveau, car elle vous permet d’étudier à la fois la structure et la fonction du cerveau vivant, non seulement dans une seule imagination, mais aussi de manière chronique à travers plusieurs imaginations sur des périodes de plusieurs mois.

Un autre avantage de la préparation de la fenêtre crânienne est qu’un grand remplissage de vue peut être imagé, ce qui permet d’imager de grandes structures telles qu’une action entière ou l’arbre inri sur une portée de quelques millimètres. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler dans les conditions les plus propres et les plus stériles possibles et d’avoir une main très stable. D’accord, et c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.