Name: Visualisation par fluorescence d’une seule molécule de la dynamique de l’ADN polymérase au niveau des G-quadruplexes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: Découvrez la dynamique de l'ADN polymérase delta face aux structures G-quadruplex par microscopie à fluorescence de molécule unique. Cette méthode révèle un nouveau mécanisme d'échange lors de la réplication.

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<ol><li>Sutton, M. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+DNA+polymerases%3A+Coordinating+DNA+replication%2C+DNA+repair%2C+and+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Managing DNA polymerases: Coordinating DNA replication, DNA repair, and DNA recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (15), 8342-8349 (2001).</li>
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<li>Chilkova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eukaryotic+leading+and+lagging+strand+DNA+polymerases+are+loaded+onto+primer-ends+via+separate+mechanisms+but+have+comparable+processivity+in+the+presence+of+PCNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA.</a> Nucleic Acids Res. 35 (19), 6588-6597 (2007).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>100 nt modèle d’ADN de contrôle</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>Modèle de contrôle primaire dans les tests d’extension d’amorce</td></tr><tr><td>100 nt Matrice d’ADN formant G4 100 nt</td> Technologies <td>d’ADN</td><td></td><td>intégrées Matrice primaire formant G4 dans les tests d’extension d’amorce</td></tr><tr><td>15 % Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel, 12 puits, 20 & micro ; L</td><td>Électrophorèse sur gel</td><td>Bio-Rad</td><td>4566055</td></tr><tr><td>20 nt Amorce marquée/biotinylée Oligonucléotide</td><td>Technologies d’ADN</td><td></td> intégrées <td>Nécessaire pour l’extension de l’amorce des 100 modèles nt 22</td></tr><tr><td>nt Modèle d’ADN</td><td>de contrôle intégré Technologies</td><td></td> d’ADN <td>intégré Modèle de contrôle primaire dans les expériences de spectroscopie de dichroïsme circulaire</td></tr><tr><td>22 nt Matrice d’ADN formant G4</td><td>ADN intégré Technologies</td><td></td><td>Gabarit primaire de formation de G4 dans des expériences de spectroscopie de dichroïsme circulaire</td></tr><tr><td>24 x 24 mm lamelle de recouvrement</td><td>Marienfeld Superior</td><td>100062</td><td>Requis pour la microscopie TIRF</td></tr><tr><td>3-aminopropyltriéthoxysilane</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10668.22</td><td>Fonctionnalisation de la lamelle</td></tr><tr><td>laser 647 nm Cohérent</td><td></td><td>1196627</td><td>Sélectionner la longueur d’onde correspondant à la tache/colorant de choix</td></tr><tr><td>Filtre d’émission 670 nm</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET655lp</td><td>Garantit que seules les longueurs d’onde pertinentes sont transmises au détecteur</td></tr><tr><td>Imageur biomoléculaire Amersham Typhoon 5</td><td>Cytiva</td><td>29187191</td><td>Analyse de gel</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-PEG-SVA-5K-100MG</td><td>Fonctionnalisation de la lamelle</td></tr><tr><td>Mélange de solutions de désoxynucléotides de triphosphate</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-1005L</td><td>Blocs de réplication</td></tr><tr><td>Bain sec numérique (115V)</td><td>Bio-Rad</td><td>1660571</td><td>Solutions de chauffage</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td>Réduction des liaisons disulfure</td></tr><tr><td>Caméra EM-CCD</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>Capture de films monomoléculaires</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>Dénaturation de l’ADN pendant ensemble Tests de réplication de l’ADN</td></tr><tr><td>Seringue étanche au gaz, 1 mL</td><td>SGE</td><td>21964</td><td>Cuvette de remplissage pour spectroscopie circulaire du dichroïsme</td></tr><tr><td>Microscope inversé avec objectif à immersion dans l’huile CFI Apo TIRF 100x</td><td>Nikon²nbsp ;</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>Facilite la microscopie TIRF à molécule unique</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre J-810</td><td>Jasco</td><td>J-810</td><td>Mesure du dichroïsme circulaire spectroscopie</td></tr><tr><td>mPEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5K-100MG</td><td>Fonctionnalisation de la lamelle</td></tr><tr><td>NanoDrop One Spectrophotomètre</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-ONE</td><td>Mesure des concentrations</td></tr> <tr><td>de protéines et d’étiquettesNeutrAvidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Liaison des modèles d’ADN aux lamelles fonctionnalisées lors d’expériences sur une seule molécule</td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène</td><td>Instech</td><td>BTPE-60</td><td>Nécessaire pour la construction de cellules d’écoulement</td></tr><tr><td>Cuvette en quartz, 10 mm</td><td>Starna Scientific</td><td>1/Q/10/CD</td><td>Contient l’échantillon pour la spectroscopie de dichroïsme circulaire</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Adelab Scientific</td><td>NE-1002X</td><td>Utilisé pour faire circuler des tampons et des substrats à travers une cellule d’écoulement microfluidique</td></tr><tr><td>Tampon Tris-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>93283</td><td>Tampon de solution d’ADN</td></tr><tr><td>Levure polymérase et delta ;</td><td>Michael O’Donnell Lab</td><td></td><td>Réplication des matrices d’ADN</td></tr><tr><td>Colonne de dessalage par spin Zeba, 7 K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89882</td><td>Purification par polymérase</td></tr></tbody></table>

visualisation par fluorescence d’une seule molécule de la dynamique de l’adn polymérase au niveau des g-quadruplexes

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

Pour ce test, deux substrats d’ADN avec une amorce de 20 nt marquée par fluorescence ont été conçus : l’un contenant une séquence formant G4 (figure 1A, à gauche) et l’autre dépourvu de cette séquence (figure 1A, à droite). Pour confirmer que le G-quadruplex est un obstacle efficace à l’activité de la polymérase, la synthèse de l’ADN par Pol δ a été suivie sur un gel PAGE dénaturant. L’activité du δ Pol marqué purifié sur les substrats d’ADN a été examinée par électrophorèse sur gel. La figure 1B (à gauche) montre que le δ Pol marqué par fluorescence est incapable de synthétiser au-delà du G-quadruplex. Avant le début de la synthèse (t = 0 min), une bande correspondant à 20 nt est présente, représentant l’amorce marquée qui a été dénaturée du brin matrice. Après 3 min, cette bande de 20 nt a été convertie en une bande de 60 nt, indiquant que la synthèse a eu lieu sur tout l’ADN et confirmant que la polymérase était complètement bloquée par la structure G-quadruplex. Ce blocage implique que la polymérase ne peut ni se déplier ni contourner la structure. En revanche, la synthèse d’un modèle de contrôle qui ne contient pas la séquence formant G-quadruplex (figure 1A, à droite) a produit une bande de 100 nt après 3 minutes (figure 1B, à droite).
Après confirmation de la synthèse sur les matrices et du blocage efficace par le G-quadruplex, ces mesures ont été répétées sur un microscope à fluorescence à molécule unique pour surveiller le comportement de la polymérase. Les matrices d’ADN ont été attachées à des lamelles fonctionnalisées (Figure 2A) dans une cellule d’écoulement microfluidique, et la position de chaque substrat a été déterminée en visualisant l’amorce marquée par fluorescence. Ensuite, le Pol δ marqué a été chargé en présence de dNTP pour lancer la synthèse. Dans un champ de vision typique, les taches individuelles sont suivies pour quantifier la fréquence à laquelle Pol δ se lie et se dissocie de l’ADN (figures 2B et C). En mesurant l’intensité en fonction du temps au niveau de chaque substrat d’ADN, il est possible de générer des trajectoires de molécules uniques (Figure 2C, Figure supplémentaire 3). Le « temps d’attente » caractéristique, c’est-à-dire la durée moyenne pendant laquelle Pol δ reste lié au modèle, peut être mesuré. Pour le substrat G4, le temps de séjour a été déterminé à 6 s ± 2 s, tandis que pour le substrat témoin, il était de 10 s ± 3 s (figure 2D, figure supplémentaire 4). De plus, pour chaque trajectoire, le nombre de fois où Pol δ se lie au modèle peut être quantifié. Le nombre d’événements de liaison au substrat G4 est beaucoup plus élevé par rapport au modèle de contrôle (Figure 2E). Bien qu’il y ait des cas de plus d’un événement de liaison dans le modèle de contrôle en raison de la liaison et de la désintégration scolaires, il y a une nette augmentation du nombre d’événements de liaison en moyenne pour le modèle de formation G4. Cela suggère que, après l’arrêt de la synthèse par le G-quadruplex, la polymérase liée se dissocie de l’ADN avant que les nouvelles polymérases de la solution n’engagent un cycle continu de liaison et de déliaison. Par conséquent, ce test à molécule unique fournit des informations inégalées sur la façon dont les ADN polymérases réagissent aux obstacles de l’ADN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig01.jpg"> 
Figure 1 : Essai d’extension de l’amorce d’ensemble. (A) Représentation schématique des substrats d’ADN. Le substrat G4 (à gauche) contient une séquence formant le G-quadruplex, alors que le substrat témoin (à droite) n’en contient pas. (B) Essai d’extension de la primase de l’ADN G4 amorcé et des substrats d’ADN témoin montrant que la levure Pol δ marquée par fluorescence est entièrement bloquée par le G-quadruplex. Le gel PAGE montre la réplication des matrices d’ADN au fil du temps, ce qui entraîne un décalage de l’amorce de 20 nt marquée dans le produit de 60 nt pour le substrat G4 (à gauche) et le produit de 100 nt pour le modèle de contrôle (à droite). M représente une échelle contenant des oligos étiquetés de 20 nt, 60 nt et 100 nt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig02.jpg"> 
Figure 2 : Microscopie à fluorescence à molécule unique. (A) Représentation schématique du test d’extension d’amorce à molécule unique à l’aide de la levure Pol δ marquée AF647. (B) Champ de vision typique obtenu à partir d’un test à molécule unique. Chaque tache représente un δ Pol marqué par fluorescence qui se lie à un modèle d’ADN. Barre d’échelle : 10 μm. (C) (En haut) Exemple de molécule du test à molécule unique montrant la liaison on/off lors des échanges de δ Pol. (En bas) Trajectoire d’une seule molécule de la même molécule montrant l’intensité au cours de l’expérience. La ligne noire représente le modèle de Markov caché (HMM) ajusté aux données. (D) Temps de séjour de Pol δ sur le substrat G4 (violet) et le substrat témoin (gris). Les lignes représentent des ajustements exponentiels, donnant une durée de vie de 6 s ± 2 s sur le substrat G4 et de 10 s ± 3 s sur le substrat de contrôle. (E) Nombre d’événements de liaison de Pol δ à des substrats d’ADN uniques. Le nombre médian d’événements de liaison sur le substrat G4 (violet) est de 3,5, par rapport au substrat témoin 1 (gris). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : spectroscopie CD. Spectres CD de la séquence formant G4 (violet) et de la séquence témoin (gris) dans un tampon TE contenant 200 mM de KCl à 25 °C. Le pic caractéristique à 260 nm, suivi du pic négatif à 240 nm, est caractéristique d’un GQ parallèle intramoléculaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%201%20(CD).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Construction de la cellule d’écoulement. (A) Schéma des différentes pièces de la cellule d’écoulement. Le bloc PDMS carré se trouve au-dessus de la lamelle du microscope. Ces pièces sont ensuite assemblées à l’intérieur du couvercle et du fond du support de cellule d’écoulement. (B) La cellule d’écoulement complète. Des tubes peuvent être insérés de chaque côté du bloc PDMS pour former les canaux à travers lesquels les tampons peuvent être écoulés à travers le dispositif via la microfluidique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%202%20(Flow%20Cell).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 3 : Trajectoires d’une seule molécule. (A) Exemple de trajectoire d’une molécule subissant un seul événement de liaison pendant les 10 minutes de l’expérience. (B) Exemple de trajectoire d’une molécule subissant des événements de liaison zéro pendant les 10 minutes de l’expérience. La ligne noire dans (A) et (B) représente l’ajustement du modèle de Markov caché (HMM) aux données. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%203%20(Extra%20Traces).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 4 : Temps de séjour. (A) Temps de séjour de la δ Pol sur le substrat G4. La ligne représente l’ajustement exponentiel, ce qui donne une durée de vie de 6 s ± 2 s. (B) Temps de séjour de Pol δ sur le substrat de contrôle. L’ajustement exponentiel donne une durée de vie de 10 s ± 3 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%204%20(Split%20Lifetimes).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 5 : Contrôle du photoblanchiment. Le graphique montre le temps moyen nécessaire pour qu’une enzyme Pol δ de levure marquée AF647 soit photoblanchie par le laser de 647 nm. La ligne représente l’ajustement exponentiel, ce qui donne une durée de vie de 39 ± 6 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%205%20(Photobleaching%20Control).pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Visualisation par fluorescence d’une seule molécule de la dynamique de l’ADN polymérase au niveau des G-quadruplexes

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA ...

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