Visualisation par fluorescence d’une seule molécule de la dynamique de l’ADN polymérase au niveau des G-quadruplexes

Nos travaux portent sur le développement et l’utilisation de la méthodologie monomoléculaire pour étudier la dynamique dans des systèmes biologiques complexes. En particulier, nous nous intéressons à savoir comment les ADN polymérases se comportent lorsqu’elles rencontrent des obstacles, dans ce cas, des G-quadruplexes. Nous avons développé une méthode à molécule unique basée sur la visualisation en fluorescence qui nous permet de voir le comportement des ADN polymérases individuelles lors de la rencontre d’un G-quadruplex.

Grâce à notre test, nous avons identifié une voie d’échange jusqu’alors non caractérisée pour l’ADN polymérase delta lors de la frappe de G-quadruplexes, dans laquelle la polymérase tombera et une nouvelle se reliera. Avec notre protocole développé, nous avons enfin répondu à la question suivante : Comment les différentes ADN polymérases se comportent-elles lorsqu’elles rencontrent un G-quadruplex, car nous pouvons voir en temps réel comment la cinétique et la mécanique changent au fil du temps ? Pour commencer, retirez une lamelle fonctionnalisée d’un aspirateur et placez-la sur un support de microtubes partiellement rempli d’eau pour créer un environnement humide.

Pipetez 100 microlitres d’un tampon de blocage dans un tube, puis ajoutez 25 microlitres de solution de NeutrAvidin et mélangez bien. Étalez la solution sur la surface de la lamelle et laissez-la incuber pendant 15 minutes à température ambiante dans la boîte humide. Ensuite, lavez la lamelle à l’eau, puis séchez-la à l’azote gazeux.

Placez un bloc de polydiméthylsiloxane sur mesure sur la lamelle à l’intérieur d’un support de cellule d’écoulement. Insérez des tubes en polyéthylène dans les trous de la cellule d’écoulement. Maintenant, chauffez des aliquotes d’un millilitre de tampon de blocage Tween, 500 microlitres de tampon de lavage et de tampon de réplication à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes pour libérer les gaz des solutions.

Dégazez les solutions dans une chambre à vide pendant 15 minutes supplémentaires à 800 millibars en dessous de la pression atmosphérique. Appliquez une goutte d’huile sur l’objectif. Prenez une cellule d’écoulement construite et placez-la sur la platine du microscope.

Ensuite, augmentez l’objectif pour atteindre le bordereau de couverture. Insérez le tube d’entrée dans le tampon de blocage Tween dégazé et connectez la sortie à la pompe à seringue. Ensuite, tirez sur la seringue pour aspirer le tampon de blocage Tween à travers le tube dans le canal.

Versez 200 microlitres de tampon de lavage dégazé dans le canal à une vitesse de 100 microlitres par minute pour rincer le tampon de blocage Tween. Maintenant, diluez les solutions de matrice d’ADN à 0,5 picomolaire dans 500 microlitres de tampon de réplication. Laissez 150 microlitres de la solution s’écouler dans le canal à raison de 10 microlitres par minute.

Illuminez l’échantillon à l’aide d’un laser de 647 nanomètres à environ 900 milliwatts par centimètre carré dans le plan de l’échantillon pour visualiser des modèles d’ADN individuels. Une fois qu’une densité suffisante de taches est visible, versez une nouvelle solution de tampon de réplication pour éliminer l’excès d’ADN. Déplacez-vous vers un nouveau champ de vision et capturez une image de l’ADN pour déterminer le degré de colocalisation entre la polymérase marquée et le substrat de l’ADN.

Une fois terminé, augmentez la puissance du laser pour photoblanchir les taches restantes. Ensuite, préparez une solution de polymérase contenant du dithiothréitol, des dNTP et une sonde fluorescente dans le tampon de réplication. Verser 100 microlitres de la solution de polymérase à une vitesse de cinq microlitres par minute dans le canal.

Une fois que l’échantillon est mis au point et que l’angle de fluorescence de réflexion interne total a été ajusté, réglez la puissance laser du laser de 647 nanomètres à environ 900 milliwatts par centimètre carré dans le plan de l’échantillon. Commencez à imager le champ de vision pendant la durée souhaitée. La séquence G-quadruplex a bloqué la synthèse de la polymérase delta, comme l’indique la présence d’une bande de 60 nucléotides dans le gel de page, tandis que le substrat de contrôle sans le G-quadruplex a produit une bande de 100 nucléotides.

La microscopie à fluorescence à molécule unique a confirmé que la polymérase delta avait un temps de séjour plus court de six plus ou moins deux secondes sur le substrat G-quadruplex, par rapport au substrat témoin, qui avait un temps de séjour de 11 plus ou moins trois secondes. Le nombre d’événements de liaison de la polymérase delta était significativement plus élevé sur le substrat G-quadruplex par rapport au contrôle, suggérant plusieurs cycles de liaison et de déliaison en raison du blocage de synthèse.