In Vivo 2-Photon Imaging calcium dans la couche 2 / 3 de souris

Pour comprendre la dynamique des réseaux des microcircuits du néocortex, il est essentiel d'enregistrer simultanément l'activité d'un grand nombre de neurones. In vivo. L'imagerie calcique est la seule méthode qui permette d'enregistrer l'activité d'une population neuronale dense avec une résolution au niveau cellulaire unique.

La méthode consiste à implanter une fenêtre d'imagerie crânienne, à injecter un colorant fluorescent au calcium qui peut être capté par un grand nombre de neurones, puis à enregistrer l'activité neuronale par imagerie calcique en laps de temps. Bonjour, je suis Payman go du laboratoire de Carlos Porter Cayo du Département de neurologie de la David Geffen School of Medicine à l'UCLA. Dans des vidéos précédentes, notre laboratoire a démontré une procédure permettant d'effectuer une craniotomie et une imagerie par photons de l'écoulement sanguin chez la souris.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'effectuer une imagerie calcique in vivo par biophotonique chez la souris. Commençons donc. Avant de commencer, la solution de colorant doit être préparée.

Tout d'abord, préparez la solution indicatrice de calcium fluorescente. Nous utilisons des colorants de type ester éthylique, ou colorants AM pour faire court. Ce sont des colorants qui peuvent être captés par les cellules lorsqu'ils sont injectés de manière extracellulaire ; nous utilisons généralement l'organogène BAFTA 1:00 AM ou le fluo 4:00 AM à une concentration de un millimolaire.

Nous préparons d'abord une solution à 20 % d'onic F1 27. Dans le DMSO, nous réchauffons la solution chaque jour avant utilisation jusqu'à ce qu'elle devienne limpide. Nous dissolvons l'indicateur de calcium dans du DMSO à 20 % d'onic F1 27 pendant 15 à 20 minutes jusqu'à une concentration de 10 millimolaire.

Nous diluons ensuite la solution à une concentration d’un millimolaire dans une solution contenant, en millimolaires, 150 de NaCl, 2,5 de KCl, 10 de HEPES, à un pH de 7,4, puis nous vortexons pendant 10 à 20 minutes supplémentaires. Nous ajoutons 100 micromolaires de sulforhodamine 101 afin de marquer sélectivement les astrocytes et de visualiser la pipette durant l’injection du colorant. Ensuite, nous implantons une fenêtre crânienne au-dessus de la zone à imager. L’approche générale de cette chirurgie est décrite par nos soins dans un article vidéo JoVE publié précédemment, mais les modifications suivantes sont importantes pour l’injection du colorant calcique.

Une craniotomie plus petite, d'un diamètre de deux millimètres, est réalisée au-dessus de la zone corticale d'intérêt, en prenant un soin extrême de ne pas endommager la dure-mère sous-jacente. Un lamelle est fixé en place au-dessus de la craniotomie, mais en la recouvrant partiellement seulement, en laissant un petit espace entre le bord de la craniotomie et le lamelle en verre afin de ménager un espace permettant à une pipette d'entrer obliquement dans le cortex avant l'injection. Un puits peu profond est formé autour de la craniotomie à l'aide de ciment dentaire.

Le puits destiné aux expériences d'imagerie calcique doit s'étendre aussi loin que possible en direction rostrale et être suffisamment peu profond pour permettre l'introduction de la micro-pipette d'injection ; nous filtrons la solution à l'aide d'un filtre centrifuge de 0,45 micron immédiatement avant l'injection. La souris est ensuite transférée sur la platine du microscope et la tête est immobilisée comme indiqué dans notre vidéo sur l'imagerie du flux sanguin. Ensuite, nous tirons des microélectrodes en verre pour obtenir un diamètre de pointe correspondant à une résistance de deux à quatre mégohms.

À l’aide d’un tireur de pipettes, le mélange de colorant indicateur de calcium est chargé dans la pipette en verre. À l’aide d’une microsyringe fixée sur un micromanipulateur, la micropipette est doucement abaissée à la surface du cerveau à l’aide d’un objectif 4 x, puis positionnée avec plus de précision. Sous un objectif 40 x, un emplacement approprié pour l’injection est choisi de manière à présenter peu ou pas de vaisseaux sanguins superficiels.

Pour rendre l'imagerie floue à l'aide d'une microscopie à deux photons, la pointe de la micropipette est visualisée et avancée lentement dans le cortex jusqu'à une profondeur de 200 micromètres sous la dure-mère. Pour effectuer cette opération avec la plus grande précision possible, le réglage de focalisation en Z de l'objectif est mis à zéro. Une fois la dure-mère visualisée, la micropipette est ensuite observée et la lecture de focalisation en Z est enregistrée tandis que la micropipette est abaissée dans le cerveau jusqu'à 200 micromètres sous la dure-mère.

Le mélange D est ensuite injecté sous pression à 10 psi pendant une minute. À l’aide d’un pico-spritzer, nous effectuons généralement deux à quatre injections du mélange de colorant calcique AM, espacées d’environ 200 à 300 micromètres. Cette méthode de chargement en masse par injections légèrement superposées garantit une coloration adéquate d’une zone pouvant atteindre 600 par 600 micromètres pour l’imagerie calcique.

L'imagerie commence une heure après l'injection du mélange de colorant AM afin de permettre au colorant de diffuser et d'être capté par les neurones. L'imagerie in vivo à deux photons est réalisée à l'aide d'un microscope à deux photons sur mesure équipé d'un laser au saphir Chameleon Ti accordé entre 800 et 880 nanomètres et de la technologie Cambridge. Les images provenant des miroirs à galvanomètre sont acquises à l'aide du logiciel ScanImage développé dans le laboratoire de Carl Vida.

La puissance laser en laboratoire est généralement nettement inférieure à 70 milliwatts au niveau de l'échantillon. Les images en champ complet sont acquises à l’aide d’un objectif Olympus 20 x 0,95 NA à raison de 1,95 à 15,63 images par seconde, avec des tailles allant de 12 par 256 pixels à 256 par 64 pixels. Les balayages linéaires sont acquis à 500 hertz pendant l’imagerie.

Les animaux sont maintenus sous une lumière isoflurane, une anesthésie de 0,6 à 0,9 %, et également conservés à 37 degrés Celsius à l’aide d’un appareil Harvard. Un dispositif de contrôle de température permet de maintenir la fréquence respiratoire des animaux aussi proche que possible de 100 mouvements par minute. Ce niveau d’anesthésie utilisé est le niveau le plus bas permettant d’immobiliser l’animal, tout en autorisant l’enregistrement d’une activité spontanée.

Examinons maintenant une expérience typique d'imagerie calcique. Il s'agit de deux ou trois neurones du cortex barillet somatosensoriel d'une souris postnatale de huit à dix jours, marqués au vert organique BTA-AM et observés avec un objectif de 20 x 0,95 NA.

Des images ont été prises toutes les 0,512 secondes. Ce film de trois minutes montre une co-activation de larges proportions de ces neurones marqués, survenant une à deux fois par minute. Nous venons de vous montrer comment réaliser un enregistrement calcique in vivo de l'activité du réseau dans les couches deux et trois du cortex cérébral.

L'avantage de cette méthode par rapport aux enregistrements électrophysiologiques est qu'elle est moins invasive et permet l'enregistrement de l'activité dans des réseaux neuronaux denses. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prendre la plus grande précaution lors de la craniotomie afin de ne pas endommager la dure-mère.

Même une petite quantité de saignement sous-dural peut grandement obscurcir l'imagerie. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.