Assemblage modulaire standardisé d’opérons polycistroniques avec clonage modulaire (MoClo) à l’aide de la boîte à outils In-Cloning

J’ai développé des méthodes permettant l’assemblage modulaire de l’ADN à partir de petites parties moléculaires individuelles jusqu’à des constructions de taille chromosomique, et de reprogrammer les cellules avec ces chromosomes artificiels. Une innovation importante dans ce domaine est le développement de kits à outils de clonage modulaire permettant l’assemblage modulaire de constructions multi-gènes à partir d’une bibliothèque de pièces moléculaires standardisées. Les kits à outils de clonage modulaire sont généralement conçus pour cloner des unités de transcription monocistroniques.

Ce protocole démontre une manière généralisable d’assembler des unités de transcription polycistronique avec la boîte à outils de clonage intégrée. Cette stratégie de clonage d’une unité de transcription polycistronique permet d’utiliser des séquences codantes de manière flexible, soit dans une unité de transcription individuelle, soit dans des arrangements polycistroniques. Pour commencer, sélectionnez les pièces de niveau 0 à assembler en une unité de transcription.

Celles-ci doivent inclure au moins un RBS, une séquence de codage et un terminateur. Choisissez la position dans laquelle l’unité de transcription sera assemblée en opéron. En fonction de la position choisie, sélectionnez le plasmide accepteur correspondant et simulez l’assemblage Golden Gate dans SnapGene.

Dans la réaction Golden Gate, utilisez l’enzyme SAP1 pour libérer le site de liaison du ribosome, la séquence codante et le terminateur de leurs plasmides respectifs et ouvrir le plasmide accepteur. Assemblez le site de liaison du ribosome, la séquence codante et le terminator dans le plasmide accepteur de coupe. Ensuite, pour la réaction Golden Gate, utilisez une pipette pour ajouter 50 femtomoles de chaque insert désiré et 50 femtomoles du plasmide accepteur.

Un microlitre de 10x tampon de ligase d’ADN T4, de ligase T4 et de SAP1 dans un tube de réaction. Ensuite, ajoutez de l’eau sans nucléase pour porter le volume final à 10 microlitres. Placez le tube dans un thermocycleur.

Exécutez 25 cycles à 37 degrés Celsius pendant trois minutes, 16 degrés Celsius pendant quatre minutes et 50 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, inactivez les enzymes à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes. En option, pipeter 0,5 microlitres de SAP1 à la réaction GG, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Pipettez cinq microlitres de la réaction mélangés en 50 microlitres de cellules E. coli chimiquement compétentes. Effectuez une transformation par choc thermique en plongeant le tube dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes, puis placez le tube sur de la glace pendant deux minutes. Ensuite, incubez les cellules dans un millilitre de milieu pendant une heure pour faciliter la récupération.

La plaque de 100 microlitres de la transformation s’étend sur une plaque de tarière LB contenant 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Faites couver l’assiette toute la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, choisissez deux colonies blanches à l’aide d’une boucle d’inoculation ou d’une pointe de pipette.

Inoculez chacun dans cinq millilitres de milieu LB contenant 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur secouant à 250 tours par minute. Effectuez une extraction à carreaux selon les instructions du fabricant.

Digérez un microgramme d’ADN plasmatique extrait en ajoutant un microlitre de tampon digestion 10x et un microlitre de BBS1. Ajoutez de l’eau sans nucléase pour atteindre le volume total de 10 microlitres et incubez. Chargez maintenant le plasmide digéré sur un gel à 1 % de agarose et effectuez une électrophorèse à 100 volts pendant 35 minutes.

Ensuite, imagez le gel et confirmez l’assemblage correct du plasmide. Pour assembler une construction de niveau M, choisissez les unités de transcription de niveau 1 à assembler. Simulez l’assemblage Golden Gate en libérant les première et deuxième unités de transcription ainsi que le liaison final à l’aide de l’enzyme BBS1.

Simultanément, on ouvre le plasmide accepteur, puis on assemble les trois parties dans le plasmide accepteur pour former l’unité transcriptionnelle polycistronique. Le contrôle négatif pour l’assemblage plasmidique de niveau 1, qui ne comportait pas de partie terminator, n’a donné aucune colonie, tandis que la réaction complète a produit 292 colonies blanches et aucune rouge. L’assemblage de la construction multi-gène sans la seconde cassette à 37 degrés Celsius n’a donné que deux colonies blanches, tandis que l’assemblage complet a donné neuf grandes colonies et 435 petites colonies.

À 30 degrés Celsius, le contrôle négatif pour l’assemblage multi-gène a donné quatre colonies blanches, tandis que la réaction complète a donné plus de 1 500 colonies. Le digest BSA1 du plasmide accepteur PMA60 donne la bande unique attendue à 5 500 paires de bases. La digestion BSA1 des plasmides de 24 colonies a révélé que 23 sur 24 présentaient le schéma de restriction correct de deux bandes à environ 4 300 paires de bases et 1 700 paires de bases.

L’imagerie de fluorescence a montré une forte fluorescence verte et cyan dans les colonies provenant de plaques contenant l’inducteur OC6, tandis que les plaques sans inducteur présentaient une fluorescence minimale ou nulle.