Optimisation de l’isolement et de la purification des cellules mésangiales glomérulaires murines

L’une de nos recherches porte sur l’insuffisance rénale liée au myélome multiple. Pour soutenir nos recherches, nous avons développé et maintenant optimisé des protocoles pour la culture primaire de cellules mésangiales murines. L’équipement nécessaire aux procédures est facilement accessible et les étapes de la procédure sont simples.

L’acquisition des cellules cibles ne nécessite que deux à trois semaines. Cette technique facilite la recherche sur les reins et soutient les études portant sur la fonction des cellules mésangiales dans des modèles de maladies, le développement thérapeutique ou la recherche sur la transduction du signal. Pour commencer l’isolement des cellules mésangiales murines, ou MC, de l’animal correctement euthanasié, à l’aide de ciseaux et d’une pince à épiler, retirez aseptiquement les reins de la souris et placez-les dans une boîte de Pétri.

Rincez les reins avec la solution saline équilibrée d’Earle, puis utilisez une pince à épiler pour retirer soigneusement le tissu conjonctif et la capsule rénale. Coupez verticalement le rein en deux à l’aide d’un scalpel. Ajoutez trois à quatre millilitres de solution de collagénase I dans la boîte de Pétri et broyez soigneusement le tissu avec un pilon en plastique.

Pipetez tous les tissus et solutions de la boîte de Pétri dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Rincez la boîte de Pétri avec un à deux millilitres de solution de collagénase I pour assurer un transfert complet des tissus. Placez le tube dans un agitateur à 37 degrés Celsius, en secouant à 120 tours par minute pendant 30 minutes.

Ensuite, ajoutez un volume égal de solution d’arrêt ou de milieu de culture au mélange. Pipetez la solution du tube à centrifuger et passez-la dans une crépine de 100 microns. Recueillir le filtrat dans un tube à centrifuger de 50 millilitres.

Faites passer le filtrat à travers une crépine de 40 microns, en ne conservant que les cellules de la passoire. Rincez la passoire à plusieurs reprises avec un milieu de culture pour maximiser la collecte de cellules. Transférez les cellules collectées de la crépine dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres.

Centrifugez la suspension à 600 g pendant cinq minutes à température ambiante. Après centrifugation, remettre les cellules en suspension dans une boîte de culture cellulaire en fonction de la densité cellulaire souhaitée. Placez les plats dans un incubateur à cellules à 37 degrés Celsius avec 95 % d’air et 5 % de dioxyde de carbone.

Ajoutez un à deux millilitres de PBS le long du bord intérieur de la boîte de culture pour rincer les cellules. À l’aide d’une pipette, retirez tout le PBS du fond de la boîte, puis ajoutez 10 millilitres de milieu de culture, un le long du bord intérieur de la boîte. Une fois que les cellules atteignent 80 % de confluence, généralement dans les sept à 10 jours, lavez les cellules deux fois avec du PBS stérile.

Ajoutez une solution de trypsine à 0,25 % dans la boîte pour trypsiniser les cellules. Placez le plat dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Lorsque la plupart des cellules présentent une morphologie arrondie et se détachent de la surface, terminez la trypsinisation en ajoutant un volume égal de milieu deux.

Centrifugez les cellules à 600 g pendant cinq minutes à température ambiante, puis remettez-les en suspension dans le deuxième milieu. Les MC isolés dans cette étude ont montré une expression significativement élevée de l’alpha-SMA, de la fibronectine et de la vimentine. La coloration immunofluorescente de MC purifiés et cultivés réalisée après 10 jours de culture dans le deuxième milieu a montré que plus de 95 % des cellules exprimaient à la fois l’alpha-SMA et la vimentine.