Détermination de la morphologie mitochondriale dans des cellules vivantes à l’aide de la microscopie confocale

Nos recherches portent sur la neuropharmacologie fondamentale. Plus précisément, nous étudions le fonctionnement des molécules médicamenteuses. Notre objectif est de comprendre la relation entre les composés médicamenteux potentiels et la fonction mitochondriale dans la maladie de Parkinson.

Des études antérieures examinent les défis de longue date de l’analyse cellulaire en laboratoire, même avec les directives du fabricant. Pour résoudre ce problème, nous avons décrit un protocole détaillé, étape par étape, pour évaluer la morphologie mitochondriale dans les cellules de laboratoire. Notre protocole utilise une simple coloration mitochondriale, l’imagerie par fluorescence et un logiciel open source.

Cela réduit les coûts, augmente l’accessibilité et le rend plus facile à utiliser que des alternatives complexes comme la microscopie électronique. Pour commencer, obtenez des cultures de cellules SH-SY5Y cultivées dans des flacons contenant du DMEM/F12, complétés par 10 % de FBS. Détachez les cellules pendant une minute à l’aide d’une solution de trypsine à 0,05 %.

Ensuite, centrifugez les cellules à 100 G pendant trois minutes avant de passer. Ensuite, suspendez les cellules SH-SY5Y dans un milieu DMEM/F12 complété par 1 % de FBS. Ensuite, ensemencez les cellules dans des boîtes confocales à fond de verre et maintenez-les pendant la nuit.

Pour la stimulation MPP+, remplacez le milieu de culture par un milieu frais avec ou sans 1-méthyl-4-phénylpyridinium pendant 24 heures. Pour la coloration de MitoTracker, diluez la solution mère de MitoTracker avec un milieu DMEM/F12 préchauffé pour obtenir une concentration de travail de 50 nanomolaires. Gardez la solution de coloration à l’abri de la lumière tout au long de la procédure.

Retirer le milieu de culture des boîtes confocales. Lavez les cellules deux fois avec du DMEM/F12 frais. Ensuite, pipetez un millilitre de la solution de travail MitoTracker dans la boîte.

Incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Retirez maintenant la solution de travail MitoTracker et lavez la vaisselle deux fois avec DMEM/F12. Après le dernier lavage, ajoutez un millilitre de DMEM/F12 dans chaque plat.

Incuber dans l’incubateur cellulaire avant l’imagerie. Pour pré-équilibrer le microscope confocal pour l’imagerie, sous le panneau d’acquisition, ajustez les paramètres du trajet lumineux en réglant les longueurs d’onde d’excitation et d’émission. Réglez la taille du sténopé sur 1,2 unité aérienne, la taille du balayage des pixels sur 1024 par 1024, le temps de séjour des pixels sur 2,4 microsecondes avec une moyenne de deux.

Utilisez maintenant la lumière halogène pour faire la mise au point sur les cellules à l’aide d’une lentille d’objectif apochromatique plan 60X avec une ouverture numérique de 1,4, minimisant ainsi la phototoxicité. Ajustez la puissance du laser et la haute tension juste en dessous du niveau de saturation. Réglez ensuite le facteur de zoom sur trois et capturez les images.

Déplacez la région d’intérêt pour vous concentrer sur d’autres cellules sous le microscope. Capturez ensuite des images sans modifier les paramètres. Pour améliorer la qualité de l’image avant la transformation binaire et la squelettisation, ouvrez d’abord l’image.

Sélectionnez une zone d’une seule cellule à l’aide de l’outil ROI. Maintenant, cliquez séquentiellement sur le processus, les filtres, la fonction de masque flou pour améliorer la netteté. Ensuite, utilisez le traitement et améliorez le contraste pour réduire l’amplification du bruit.

Cliquez sur le processus, les filtres et l’option médiane pour supprimer le bruit du sel et du poivre. Pour convertir l’image en binaire, cliquez sur processus suivi de binaire et choisissez l’option rendre binaire. Squelettez l’image binaire en cliquant sur Traiter, Binaire et Squelettiser.

Regroupez ensuite tous les pixels du squelette en sélectionnant analyser, suivi de squelette et analyser la fonction 3D 2D du squelette. Simplifiez l’analyse en utilisant l’outil MiNA pour calculer neuf paramètres descriptifs dans l’image squelettée. L’intensité de fluorescence de la coloration mitochondriale a augmenté progressivement avec la concentration de CMXRos rouge de MitoTracker de 25 nanomolaires à 200 nanomolaires.

Mais à 200 nanomolaires, une coloration de fond cytoplasmique substantielle a été observée. La morphologie mitochondriale a été mieux préservée dans le milieu DMEM/F12 par rapport au PBS une heure après la coloration, bien que le DMEM/F12 ait également montré une fluorescence de fond plus élevée. La moyenne à double image a considérablement amélioré le rapport signal/bruit en imagerie mitochondriale par rapport au mode de balayage unique.

Et l’augmentation du temps de séjour des pixels de 2,4 à 10,8 microsecondes a permis d’obtenir des images plus lumineuses, mais a provoqué un photoblanchiment. L’augmentation de la haute tension a intensifié le bruit de fond, tandis que l’augmentation de la puissance laser a conduit au photoblanchiment. L’outil MiNA a produit des sorties de squelettage cohérentes pour les images sombres et lumineuses, indiquant une segmentation robuste entre différentes intensités de fluorescence, l’image lumineuse présentant une intensité 5,5 fois supérieure à celle de l’image sombre.

Le traitement MPP+, à 500 micromolaires, a perturbé la morphologie mitochondriale dans les cellules SH-SY5Y par rapport au témoin non traité, ce qui a entraîné une réduction significative de l’empreinte mitochondriale.