Préparation mitochondriale à partir de microglie pour l’analyse des glycanes

De manière générale, nos recherches visent à déterminer le rôle mécaniste des sucres, ou glycanes, et à déterminer comment nous pouvons tirer parti de ces voies de glycosylation cellulaire et subcellulaire dans le vieillissement ainsi que dans les troubles cérébraux. À l’heure actuelle, il existe une lacune dans les connaissances sur le rôle et la modulation des glycanes subcellulaires dans différentes physiopathologies de maladies, y compris les troubles cérébraux aigus et chroniques comme les accidents vasculaires cérébraux et la maladie d’Alzheimer. Ce protocole et nos recherches visent à faire progresser les connaissances sur le rôle des glycanes dans les interactions neuroimmunitaires et sur la façon dont ces informations peuvent être exploitées pour concevoir des thérapies meilleures et efficaces pour le système nerveux central.

[Narrateur] Pour commencer, obtenez des cellules microgliales BV-2 dérivées de souris C57BL/6. Maintenez-les dans un milieu à faible teneur en glucose DMEM complété par 10 % de FBS, 1 % de pénicilline streptomycine et 1 % d’acides aminés non essentiels. Faites pousser les cellules dans des flacons T175 jusqu’à ce qu’elles atteignent 70 à 80 % de confluence. Aspirez le support de la fiole. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu de croissance. À l’aide du bleu trypan, comptez les cellules. Centrifugez les cellules dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres à 500 G pendant cinq minutes. Aspirez et jetez soigneusement le surnageant. Ajoutez 800 microlitres de réactif d’isolement mitochondrial A et vortex à vitesse moyenne pendant cinq secondes. Ensuite, incubez le tube sur de la glace pendant exactement deux minutes. Ajoutez 10 microlitres de réactif d’isolement mitochondrial B et vortex à vitesse maximale pendant cinq secondes. Incuber sur la glace pendant cinq minutes, en tourbillonnant à la vitesse maximale chaque minute. Ajoutez maintenant 800 microlitres de réactif d’isolement mitochondrial C et retournez le tube pour mélanger. Et centrifuger à 700 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de deux millilitres et centrifugez à 3 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant contenant la partie cytosolique dans un nouveau tube. La pastille contient les mitochondries isolées. Ajoutez 500 microlitres de réactif d’isolement mitochondrial C à la pastille et centrifugez à 12 000 G pendant cinq minutes. Remettre en suspension les mitochondries isolées dans 50 microlitres de tampon d’isolement de protéines. Laissez la suspension sur la glace pendant 20 minutes. Aspirez et distribuez trois fois, et laissez sur la glace pendant 20 minutes, en tourbillonnant avant utilisation. S’il n’est pas complètement solubilisé, ajoutez 50 microlitres supplémentaires de tampon et de piscine dans le même tube. Centrifuger à 13 000 G pendant 10 minutes. Après avoir récupéré et congelé le surnageant, séchez-le à l’aide d’un concentrateur sous vide. Pour la détection des glycanes libérés, remettre en suspension les glycanes séchés et liés dans 50 microlitres d’eau de qualité LCMS. Pipeter cinq microlitres de glycanes mitochondriaux remis en suspension sur un point d’échantillon sur une lame de micropuits en téflon. Ioniser et détecter les N-glycanes en mode ionisation négative à l’aide d’un solvant par électronébulisation composé de 60 % d’acétonitrile et d’un millimolaire d’acide acétique à un débit de deux microlitres par minute et une tension de 3,2 kilovolts. Couplez IR-MALDESI à un spectromètre de masse HRAM réglé à un pouvoir de résolution de 240 000 sur toute la largeur à mi-maximum avec un rapport masse/charge de 200 pour analyser un rapport masse/charge de 502 000 en mode ionisation négative. Identifiez manuellement les glycanes liés à l’N en recherchant des masses monoisotopiques. Confirmez les distributions isotopiques à l’aide de l’espacement masse/charge pour déterminer les ions doublement et triplement chargés avec un seuil de flux d’ions minimum de 1 000 ions par seconde. Convertissez les spectres de masse brute pour les rapports masse/charge en masses monoisotopiques neutres. Ensuite, téléchargez les masses monoisotopiques sur un outil de prédiction de la structure des oligosaccharides en ligne pour déterminer les compositions potentielles des glycanes. Confirmez les annotations à l’aide d’une base de données de glycos organisée expérimentalement. Assurez-vous que chaque identification se situe dans une marge de précision de mesure de 2,5 parties par million de masse, qu’elle contient le noyau et la structure des glycanes liés, et qu’elle exclut le pentose, l’acide 3-désoxy-d-manno-oct-2-ulosonique ou les monosaccharides d’acide uronique. Les concentrations en protéines mitochondriales obtenues à partir de six préparations indépendantes n’ont montré aucune variation significative, confirmant une reproductibilité élevée. L’analyse sanguine de Western a montré que l’expression de CoxIV n’était que dans les fractions mitochondriales et que la GAPDH n’était que dans les fractions cytoplasmiques, confirmant la pureté des isolements mitochondriaux et l’absence de contamination non mitochondriale. Des structures distinctes de N-glycanes sialylés, phosphorylés et sulfatés ont été détectées dans des extraits mitochondriaux à l’aide d’IR-MALDESI. Des valeurs quadratiques élevées testant une qualité d’ajustement ont confirmé la détection de glycanes liés à l’azote avec un et deux adduits au chlore, confirmant la détection de ces compositions de glycanes à l’aide de IR-MALDESI.