Identification d’espèces de mycobactéries par la méthode d’une puce à ADN

[Narrateur] Cette recherche porte sur le diagnostic moléculaire en microbiologie clinique. Par rapport aux méthodes de détection traditionnelles, la méthode de la puce à ADN pour identifier les espèces de mycobactéries est très sensible, spécifique et rapide, ce qui peut fournir une aide importante pour le diagnostic précoce des patients cliniques. À l’heure actuelle, les méthodes d’identification rapide des mycobactéries non tuberculeuses sont limitées dans de nombreux laboratoires de base, ce qui a un impact direct sur le diagnostic clinique et le traitement des patients. Pour commencer, réglez la température du bain-marie à température constante à 50 degrés Celsius et préchauffez-le. Pour préparer les puces, ajoutez 200 microlitres d’eau distillée au fond de la boîte d’hybridation de puces de puces à gènes. Placez le support entre les deux colonnes de positionnement à l’intérieur de la boîte. Placez soigneusement la puce avec la face avant vers le haut sur le support et couvrez-la avec la lamelle de manière à ce qu’elle soit à quatre bossages face vers le bas, en veillant à ce que l’extrémité de la lamelle s’aligne avec l’étiquette à l’extrémité de la puce. Ensuite, préparez des tubes à centrifuger de 200 microlitres, ou huit bandes de puits en fonction du nombre d’échantillons et étiquetez-les correctement. Chauffez le tampon d’hybridation du kit à 50 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit complètement fondu. Après un mélange minutieux, centrifugez-le rapidement dans une micro-centrifugeuse. Aliquote neuf microlitres de tampon d’hybridation dans chaque tube ou bandelette préparé. Ajoutez six microlitres du produit PCR correspondant dans chaque tube, ce qui donne un volume final de 15 microlitres par mélange réactionnel. Chauffez le mélange de réaction d’hybridation à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour le dénaturer à l’aide d’un instrument PCR ou d’un bain-marie. Après le traitement de dénaturation, plongez immédiatement le mélange dans un mélange d’eau glacée et incubez pendant trois minutes. Retirez le mélange de réaction d’hybridation du bain de glace et mélangez-le en le pipetant deux fois de haut en bas. Lorsqu’il ne reste plus de précipité floculant blanc, ajoutez 13,5 microlitres du mélange réactionnel par le trou de chargement de la lamelle. Couvrez et scellez rapidement la boîte d’hybridation et notez le numéro de puce, la position de la puce et le numéro d’échantillon. Maintenant, placez les boîtes d’hybridation scellées horizontalement dans le bain-marie à température constante qui a été préchauffé à 50 degrés Celsius. Après avoir placé toutes les boîtes à l’intérieur, démarrez la minuterie pendant 120 minutes. Une fois la réaction d’hybridation terminée, sortez les boîtes d’hybridation horizontalement, démontez-les et récupérez les copeaux. Placez immédiatement les copeaux sur la grille coulissante à l’intérieur d’un récipient rempli de solution de lavage de copeaux I qui a été équilibré à la température ambiante et lavez-les à 80 à 100 tr/min sur un agitateur à température constante pendant trois minutes à température ambiante. Lavez à nouveau les copeaux avec la solution de lavage de copeaux II sur le shaker réglé sur 80 à 100 tr/min pendant trois minutes à température ambiante. Maintenant, placez les copeaux dans une centrifugeuse et faites-les tourner à 100 g pendant cinq minutes à température ambiante. Allumez le scanner. Et puis ouvrez le logiciel correspondant. Cliquez sur le bouton de contrôle laser pour lui permettre de préchauffer pendant 10 minutes. Entrez les informations relatives aux échantillons dans le logiciel. Une fois le préchauffage du scanner terminé, cliquez sur le bouton Éjecter. Placez les copeaux séchés fermement sur le petit morceau du support. Poussez la puce doucement et horizontalement dans le compartiment du scanner et cliquez sur le bouton Charger. Maintenant, entrez le numéro de puce dans le logiciel et cliquez pour sélectionner la zone de détection microarray 1 à 4. Cliquez sur Sélectionner un échantillon pour choisir les échantillons correspondants pour chaque microarray. Cliquez ensuite sur Démarrer la détection pour commencer l’analyse de la puce. Les résultats de l’analyse s’afficheront à l’écran et seront automatiquement enregistrés. Utilisez la page de requête de données pour effectuer des requêtes de données et des opérations d’impression. Après avoir terminé toutes les opérations, éteignez le laser, quittez le logiciel et enfin, éteignez le scanner. La validité des résultats expérimentaux est confirmée par le contrôle de la qualité, le témoin positif donnant un résultat de détection du complexe mycobacterium tuberculosis et le témoin négatif ne donnant aucun résultat de mycobacterium. L’interprétation des échantillons d’essai commence par les cas où toutes les sondes, y compris celle ayant la valeur de signal la plus élevée, sont négatives, ce qui entraîne un rapport d’absence de mycobactérie. Dans les échantillons où seule la sonde du complexe mycobacterium tuberculosis montre un signal fort, le résultat est identifié comme positif pour ce groupe d’espèces. Si la sonde correspondant à mycobacterium avium est la seule avec un signal fort, l’échantillon est identifié comme positif pour mycobacterium avium. Si seule la sonde de contrôle interne est positive et que toutes les autres sont négatives, le résultat est déclaré indéterminé, ce qui indique la présence d’une espèce de mycobactérie non couverte par le kit de détection.