Name: Cytométrie phosphoflow intracellulaire des xénogreffes dérivées de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Apprenez la cytométrie phosphoflow intracellulaire pour analyser les voies de signalisation mTORC1, JAK/STAT5 et MAPK dans les cellules de leucémie myéloïde aiguë dérivées de xénogreffes de patients.

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<ol><li>Ferrara, F., Schiffer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukaemia+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukaemia in adults.</a> Lancet. 381 (9865), 484-495 (2013).</li>
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<li>Sung, P. J., Sugita, M., Koblish, H., Perl, A. E., Carroll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cytokines+mediate+resistance+to+targeted+therapy+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cytokines mediate resistance to targeted therapy in FLT3-ITD acute myeloid leukemia.</a> Blood Adv. 3 (7), 1061-1072 (2019).</li>
<li>Song, P., Yang, F., Jin, H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+protein+translation+and+its+implications+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">The regulation of protein translation and its implications for cancer.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 68(2021).</li>
<li>This Standard Operating Procedure (SOP) describes methods for anesthetizing mice. , McGill University. 
 <a target="_blank" href="https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf">https://www.mcgill.ca/research/files/research/110-mouse_anesthesia-2024-06-17.pdf</a> (2024).</li>
<li>Tech Team Tips: Preparing a Sample with AO/PI. , DeNovix. 
 <a target="_blank" href="https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi">https://www.denovix.com/webinars/tech-team-tips-preparing-a-sample-with-ao-pi</a> (2021).</li>
<li>Suni, M. A., Maino, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell signaling proteins.</a> Methods Mol Biol. 717, 155-169 (2011).</li>
<li>Krutzik, P. O., Irish, J. M., Nolan, G. P., Perez, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+phosphorylation+and+cellular+signaling+events+by+flow+cytometry%3A+techniques+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications.</a> Clin Immunol. 110 (3), 206-221 (2004).</li>
<li>Chen, W., Luu, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+by+multiparameter+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping by multiparameter flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1633, 51-73 (2017).</li>
<li>Perez, O. D., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-proteomic+immune+analysis+by+flow+cytometry%3A+From+mechanism+to+translational+medicine+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phospho-proteomic immune analysis by flow cytometry: From mechanism to translational medicine at the single-cell level.</a> Immunol Rev. 210, 208-228 (2006).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Seringues de 1 mL 25G x 5/8 TW&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>#309626</td><td>Seringues pour l’aspiration de la moelle osseuse</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 1,7 ml</td><td>FroggaBio</td><td>#LMCT1,7 milliards</td><td>Aliquote des cellules récupérées par aspiration de la moelle osseuse</td></tr><tr><td>BD Horizon Tampon à taches brillantes</td><td>BD Biosciences</td><td>#563794</td><td>Pour les processus de coloration</td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>Fidelis Santé animale</td><td>Ethiqa XR</td><td>Analgésie chez la souris</td></tr><tr><td>CellDrop FL Illimité</td><td>FroggaBio</td><td>#CellDrop FL- UNLTD</td><td>Pour la numération cellulaire</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Wisent Inc.</td><td>#311-425-CL</td><td>Milieux pour cellules prélevées par aspiration de la moelle osseuse</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Eppendorf 5427 R</td><td>Millipore Sigma</td><td>#EP5429000260</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur Premium CA</td><td>Wisent Inc.</td><td>#090-450</td><td>Pour les processus de coloration</td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde</td><td>Millipore Sigma</td><td>#F1635</td><td>Perméabilisation cellulaire</td></tr><tr><td>anticorps CD45 [HI30] humain&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>#563792</td><td>Anticorps couplé à BUV395</td></tr><tr><td>Analyseur de cellules spectrales ID7000</td><td>Sony</td><td></td><td>Analyseur de cytomètre en flux spectral</td></tr><tr><td>Isoflurane 99,9 % liquide</td><td>Mckesson</td><td>#803250</td><td>Anesthésie pour les souris</td></tr><tr><td>Isospire (isoflurane) Anesthésique par inhalation</td><td>Dechra</td><td></td><td>Anesthésie pour les souris</td></tr><tr><td>Vivant/mort AO/PI</td><td>FroggaBio</td><td>CD-AO/PI-1.5</td><td>Pour la numération cellulaire</td></tr><tr><td>Zombie vivant/mort NIR</td><td>BioLégende+B6 :C12</td><td>#423106</td><td>Pour la cytométrie en flux spectral</td></tr><tr><td>Solution de méthanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>#179957</td><td>Fixation des cellules</td></tr><tr><td>Anticorps P-4EBP1 (Thr37/46) [236B4]</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>#2846</td><td>Anticorps couplé à Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anticorps p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) [197G2]</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>#13148</td><td>Anticorps couplé à Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Anticorps p-RPS6 (Ser240/244) [D68F8]</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>#9468</td><td>Anticorps couplé à Alexa Fluor 594</td></tr><tr><td>Anticorps p-STAT5 (Tyr694) [D47E7]</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>#14603</td><td>Anticorps couplé à du PE</td></tr><tr><td>Contrôle IgG du lapin [DA1E]</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>#2975</td><td>Anticorps couplé à Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Contrôle IgG du lapin [DA1E]</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>#2985</td><td>Anticorps couplé à Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Contrôle IgG du lapin [DA1E]</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>#8760</td><td>Anticorps couplé à Alexa Fluor 594</td></tr><tr><td>Contrôle IgG du lapin [DA1E]</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>#5742S</td><td>Anticorps couplé à du PE</td></tr><tr><td>Lingettes désinfectantes</td><td>Canada-Uni</td><td>#UCDWPR-9022</td><td>Désinfection pour l’aspiration de la moelle osseuse</td></tr></tbody></table>

cytométrie phosphoflow intracellulaire des xénogreffes dérivées de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë

Intracellular Phosphoflow Cytometry of Acute Myeloid Leukemia Patient-Derived Xenotransplants

La conception expérimentale vise à surveiller l’état de phosphorylation de protéines d’intérêt sélectionnées à différents moments, par exemple, 1 jour avant le début du traitement et 15 jours après le début du traitement. Cette ligne de base sert de contrôle critique pour vérifier la véracité des changements ultérieurs dans l’activation de la voie de signalisation après le traitement. Après quinze jours de traitement, une deuxième comparaison est effectuée pour évaluer la modulation des voies chez les souris traitées par rapport aux témoins traités par véhicule (Figure 4). Cette approche en deux étapes permet de distinguer les effets induits par le traitement de la variabilité initiale.
Pour cette étude, un modèle murin AML PDX a été utilisé. Les souris ont été transplantées avec des cellules LMA dérivées de patients caractérisées par les mutations suivantes : DNMT3AMR882H avec une fraction allélique variant (VAF) de 48 %, NPM1W288fs VAF 36 %, FLT3ITD VAF 10 % et IDH2R140Q VAF 44 %. Après la transplantation, trois semaines ont été accordées à la croissance tumorale avant de commencer le traitement. Les souris PDX transplantées avec le mutant FLT3 ont été traitées pendant quinze jours avec l’un des trois schémas suivants : placebo, giltéritinib (15 mg/kg par jour) ou une combinaison de vénétoclax (50 mg/kg par jour), de 5-azacitidine (2,5 mg/kg par jour) et de cedarizudine (3 mg/kg par jour) (figure 4A).
En ce qui concerne les résultats obtenus, il convient de mentionner que le traitement avec un régime à base de vénétoclax a entraîné une augmentation significative de la phosphorylation de STAT5 et RPS6, suggérant que ces voies contribuent à la résistance au traitement (Figure 4E). En revanche, le giltéritinib, un médicament ciblant FLT3, n’a pas réduit l’état de phosphorylation des effecteurs mutants de FLT3. Il est possible que dans l’échantillon de LAM testé, la présence de mutations secondaires supplémentaires autres que FLT3-ITD (par exemple, IDH2) contribue à l’activation de ces voies ou que le traitement médicamenteux de plus de deux semaines entraîne une élimination sélective des cellules LMA avec une diminution de la signalisation. Étant donné que toutes les phosphoprotéines analysées proviennent de la même population cellulaire, il est possible de comparer l’activation des phosphoprotéines. Dans cette expérience, la corrélation la plus forte dans la coloration des phosphoprotéines semble être entre p-STAT5 et p-RPS6 (Figure supplémentaire 1A), qui sont toutes deux régulées à la hausse dans ce groupe expérimental après traitement (Figure 4E). Il semble y avoir une relation moindre entre p-STAT5 et p-ERK (figure supplémentaire 1B). Il est important de noter que la taille des cellules (évaluée à l’aide de FSC-A) n’est pas un contributeur majeur à la positivité globale de p-STAT5, ce qui souligne que la positivité de la coloration n’est pas simplement un produit de la taille de la cellule (figure supplémentaire 1C). Ce cadre expérimental permet une évaluation complète des effets de ces traitements sur la modulation des voies de signalisation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig01.jpg"> 
Figure 1 : Visualisation des voies de signalisation cibles et stratégie d’analyse. (A) Vue d’ensemble des voies de signalisation impliquant p-STAT5 (Tyr694), p-4EBP1 (Thr37/46), p-RPS6 (Ser240/244) et p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204). Dans la voie p-STAT5, JAK subit une autophosphorylation, augmentant son activité catalytique, puis phosphoryle des résidus de tyrosine spécifiques, créant ainsi des sites d’amarrage pour les protéines STAT. STAT5 phosphorylé (Tyr694) s’homodimérise et se déplace dans le noyau, où il se lie à des éléments spécifiques sensibles à STAT dans les régions promotrices des gènes cibles. Dans la cascade RAS-RAF-MEK-ERK, l’autophosphorylation du récepteur FLT3 ou d’autres récepteurs tyrosine kinases (RTK) lors de la liaison du ligand conduit à l’échange de GDP pour GTP sur RAS, activant ainsi RAS. Le RAS-GTP activé recrute la RAF dans la membrane plasmique, où la RAF subit un changement de conformation et devient active. RAF phosphoryle et active MEK1/2, une kinase à double spécificité, qui à son tour phosphoryle ERK au niveau des résidus Thr202/Tyr204. ERK1/2 activé se déplace dans le noyau, où il phosphoryle des facteurs de transcription spécifiques. ERK1/2 est également capable, par des voies de signalisation intermédiaires, d’augmenter l’activité de mTORC1 et de phosphoryler eIF4E à des sites spécifiques pour augmenter l’activité de traduction. Activé par les nutriments et les facteurs de croissance via FLT3 et d’autres RTK, mTORC1 phosphoryle des cibles en aval comme S6K1 et 4E-BP1. S6K1, à son tour, phosphoryle RPS6, ce qui améliore la fonction des ribosomes et active la traduction. L’hyperphosphorylation de 4E-BP1 libère eIF4E, permettant l’assemblage du complexe d’initiation de traduction eIF4F et l’activation de la traduction dépendante de la coiffe. Toutes ces voies sont fortement impliquées dans la LAM, contribuant aux adaptations acquises en augmentant la prolifération cellulaire, le métabolisme et la résistance aux signaux apoptotiques. (B) présente les principales étapes du protocole couplé d’aspiration de la moelle osseuse et de coloration phosphoflow intracellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig02.jpg"> 
Figure 2 : Visualisation des étapes critiques de la procédure d’aspiration de la moelle osseuse. La zone chirurgicale et le matériel nécessaire sont mis en place sous une hotte à flux laminaire. Après une anesthésie par inhalation d’isoflurane (A), la surface articulaire fémorale est préparée pour l’aspiration (B,C). L’os fémoral est perforé par une première seringue alignée au milieu de l’os fémoral (D). Il est essentiel d’éviter d’appliquer une forte pression sur l’aiguille et d’effectuer plutôt un mouvement de forage rotatif ; Cela suffit généralement à l’aiguille pour perforer la surface de l’os et suivre le chemin de la cavité fémorale. Ensuite, la moelle osseuse est aspirée avec une deuxième seringue à travers le site de ponction (I, J). Après avoir transféré l’aspiration de moelle osseuse dans un tube de microcentrifugation (K), une légère pression est appliquée pour arrêter le saignement dans la zone (L), et la souris est placée dans une cage chaude et propre pour la récupération. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig03.jpg"> 
Figure 3 : Flux de travail pour l’analyse de la stratégie de contrôle, y compris les contrôles d’isotype. (A) représente les stratégies de contrôle pour les cellules vivantes, l’exclusion des doublets et des cellules AML hCD45-positives. (B) montre des signaux pour chaque phosphoprotéine en brun et des contrôles d’isotype en noir (deux réplicats biologiques). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68244/68244fig04.jpg"> 
Figure 4 : Flux de travail pour la détection et l’analyse des phosphoprotéines intracellulaires après immunodétermination de cellules LMA viables dans la moelle osseuse. (A) Des souris NSG-SGM3 greffées avec des cellules LMA données par le patient ont été traitées avec un véhicule (contrôle) ou vénétoclax, de la 5-azacytidine et de la cédazuridine (vene/aza/CDZ) ou du giltéritinib. Après 15 jours, les ponctions de moelle osseuse (BM) ont été traitées. (B) représente la stratégie de contrôle pour l’analyse des cellules LMA viables (p. ex., hCD45/Zombie-NIR positives) 15 jours après le traitement. (C,D) représentent la normalisation du signal pour chacun des phosphoanticorps indiqués, dans 10 000 cellules de LMA isolées de souris traitées avec du vénétoclax/5-azacytidine/cédazuridine ou véhicule (B) ou gilteritinib ou véhicule (C). Les traces représentent les signaux dans les cellules LMA isolées de la souris témoin traitée avec véhicule (bleu clair), vene/aza/CDZ (rouge) ou gilteritinib (violet). (E) L’histogramme représente les variations moyennes de la valeur des intensités de coloration pour chaque phosphoprotéine testée sur des cellules CD45+ de LMA humaines vivantes provenant de trois souris et de l’écart-type. Les astérisques indiquent des différences significatives dans les intensités de coloration évaluées par ANOVA avec des valeurs p inférieures à 0,05 (*) et 0,01 (**). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/68244fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anticorps</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-RPS6 (Ser240/244)</td>
			<td>AF594</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-4EBP1 (Thr37/46)</td>
			<td>AF488</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-STAT5 (Tyr694)</td>
			<td>PE</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204)</td>
			<td>AF647</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrôle des IgG chez le lapin</td>
			<td>AF594</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrôle des IgG chez le lapin</td>
			<td>AF488</td>
			<td>1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrôle des IgG chez le lapin</td>
			<td>PE</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrôle des IgG chez le lapin</td>
			<td>AF647</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Liste des dilutions optimisées pour les anticorps.
Figure supplémentaire 1 : Comparaison de p-STAT5, p-RPS6, p-ERK1/2 et FSC-A dans un échantillon représentatif de PDX AML. Cette figure montre un exemple de la relation entre p-STAT5, p-ERK et p-RPS6 chez la souris « E9 » au 15e jour du traitement par vénétoclax/5-azacitidine/cédazuridine (résultat de la figure 4C). Dans cet échantillon, la corrélation la plus forte dans la coloration des phosphoprotéines semble être entre p-STAT5 et p-RPS6 (A), qui sont toutes deux régulées à la hausse dans ce groupe expérimental après traitement (Figure 4E). Il semble y avoir une relation moindre entre p-STAT5 et p-ERK (B). Il est important de noter que la taille des cellules (évaluée à l’aide de FSC-A) n’est pas un contributeur majeur à la positivité globale de p-STAT5, ce qui souligne que la positivité de la coloration n’est pas simplement un produit de la taille de la cellule (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68244/Figure%20S1%20jove.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Cytométrie phosphoflow intracellulaire des xénogreffes dérivées de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë

To adapt and resist approved treatments, acute myeloid leukemia (AML) cells activate specific molecular pathways that lead to changes in gene expression, ...

Notre recherche vise à comprendre comment la leucémie myéloïde aiguë développe une résistance aux traitements approuvés. Basé sur l’hypothèse que le métabolisme joue un rôle clé. Le but ultime est d’identifier une stratégie qui peut surmonter efficacement cette résistance. La cytométrie en flux, largement utilisée dans la recherche sur la leucémie, est idéale pour analyser les cellules en suspension comme les cellules leucémiques. Son adaptabilité en fait un outil puissant pour les mécanismes moléculaires de données. Le principal défi expérimental de la recherche sur la LMA est de développer un protocole in vivo optimal pour la revitalisation moléculaire, c’est-à-dire la cellule pour une modélisation précise, la compréhension du mécanisme sous-jacent à la résistance thérapeutique.[Narrateur] Pour commencer, pliez le genou de la souris et utilisez la main non dominante pour immobiliser la jambe afin d’exposer la surface articulaire du fémur où se trouve le côté de la perforation. Placez le pouce sur le tibia, l’index sur le fémur et le majeur sur la face externe des os pour les stabiliser. Tout en maintenant l’immobilisation, désinfectez la zone du genou avec de l’alcool isopropylique pour écarter les cheveux restants et améliorer la visualisation de la structure osseuse. À l’aide de la première seringue sèche de calibre 25, positionnez l’aiguille au milieu de l’articulation du fémur et faites-la pivoter doucement pour créer un trou dans la surface articulaire fémorale sans appliquer de force. Une fois que l’aiguille est entrée dans la moelle, retirez progressivement la seringue tout en la tournant. Insérez la deuxième seringue rincée dans le trou créé par la première aiguille. Appliquez le vide sur la deuxième seringue insérée dans le fémur tout en la tournant doucement et en la retirant progressivement. Transférez la moelle osseuse extraite en rinçant le contenu de la seringue dans un microtube à centrifuger réfrigéré contenant 500 microlitres de PBS. Conservez l’échantillon sur de la glace. Appliquez une légère pression sur le site de ponction à l’aide d’un écouvillon d’isopropanol pendant 30 secondes pour arrêter tout saignement. Centrifugez les cellules à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’un système d’aspiration intra-utérine, aspirez doucement et jetez le surnageant. Ajouter 200 microlitres par échantillon de solution de coloration cellulaire fluorescente. Dilué un à 100 dans du PBS pour marquer les cellules mortes. Remettez doucement les cellules en suspension à l’aide d’une pipette. Incuber ensuite les cellules sur de la glace pendant 10 minutes, à l’abri de la lumière. Après 10 minutes, centrifugez les cellules à 500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez et jetez le surnageant à l’aide d’un système de vide, ajoutez 100 microlitres par échantillon d’anticorps ultraviolets brillants HCD 45 395 dilués à un à 100 dans du PBS contenant 2 % de sérum fœtal bovin pour marquer les cellules hématopoïétiques humaines. Incuber les cellules sur de la glace pendant 15 minutes, en veillant à ce qu’elles soient protégées de la lumière. Centrifugez les cellules à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez et jetez le surnageant à l’aide d’un système de vide. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de formaldéhyde à 1,6 % dans une solution de PBS. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes, à l’abri de la lumière. Après 10 minutes, centrifugez les cellules à 500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez et jetez le surnageant à l’aide d’un système de vide. Ajoutez maintenant un millilitre de méthanol à 100 %, pré-refroidi à moins 20 degrés Celsius directement dans les deux. Incuber les échantillons à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes à l’abri de la lumière. Centrifugez les cellules à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’un système d’aspiration, aspirez et jetez le surnageant. Ajoutez 50 microlitres de solution mixte d’anticorps ou de solution mixte de contrôle d’isotype à chaque échantillon. Remettez doucement les cellules en suspension à l’aide d’une pipette, incubez tous les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius, en veillant à ce qu’ils soient protégés de la lumière. Ensuite, centrifugez les cellules à 500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, lavez les cellules avec 1000 microlitres de PBS en les remettant doucement en suspension à l’aide d’une pipette. Centrifugez à nouveau les cellules à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, effectuez un deuxième lavage à l’aide de 1000 microlitres de PBS et remettez doucement les cellules en suspension à l’aide d’une pipette avant de centrifuger à nouveau les cellules à quatre degrés Celsius. Après avoir aspiré le surnageant, remettre en suspension les échantillons finaux dans 200 microlitres de PBS. Cette figure illustre le flux de travail, la stratégie de contrôle et la normalisation des signaux intracellulaires de la phosphoprotéine dans les cellules de la moelle osseuse de souris xénogreffes dérivées de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë traitées avec un traitement à base de vénétoclax pendant 15 jours. La stratégie de déclenchement a permis d’identifier des cellules viables de leucémie myéloïde aiguë humaine ou LMA sur la base des profils de diffusion directe et latérale et de la positivité de CD45, ce qui a permis une analyse cohérente dans tous les groupes de traitement. Le traitement par le vénétoclax 5-azacitidine et l’uridine CDZ ont entraîné une augmentation de la phosphorylation de STAT5 et RPS6 dans les cellules LMA, suggérant l’activation des voies de survie associées à la résistance. Fait intéressant, lorsque les souris ont été traitées avec du giltéritinib, le traitement n’a pas réduit de manière significative la phosphorylation des protéines de la voie FLT3, ce qui indique que la signalisation a persisté malgré le traitement ciblé. STAT5 phosphorylé et RPS6 phosphorylé ont montré la plus forte augmentation de corrélation des niveaux d’expression après un traitement à base de vénétoclax, indiquant une co-activation de ces voies.

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Cette vidéo démontre l’évaluation de la phosphorylation intracellulaire des protéines induite par les cytokines stromales dans les cellules leucémiques. Ces protéines phosphorylées intracellulaires sont quantifiées à l’aide de la technique de cytométrie phospho-flux.

Évaluation de la phosphorylation des protéines intracellulaires induite par les cytokines stromales à l’aide de la cytométrie phospho-flow

Nous exposons un protocole visant à détecter l’expression simultanée des marqueurs de cellules souches de la leucémie sur les cellules de la leucémie myéloïde aiguë primaire par cytométrie en flux. Nous montrons comment quantifier les trois populations de souches et une population de LSC putative augmente le degré de maturation. Nous avons confirmé la présence de ces populations correspondantes patient-dérivés-xénogreffes.

Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut

La procédure expérimentale sur l’immunophénotypage des homogreffes ACPE orthotopique murine vise à présenter le profil immuno-microenvironnement tumoral. Les tumeurs sont orthotopically implanté par la chirurgie. Tumeurs de 200 à 600 mm3 de taille ont été récoltés et dissociées pour préparer des suspensions unicellulaires, suivies d’analyse multi-immunitaire marqueur FACS à l’aide de différents anticorps fluorescent marqués.

Immunophénotypage de homogreffe orthotopique (syngéniques) d’adénocarcinome Ductal pancréatique KPC primaires murines par cytométrie en flux

Nous décrivons une méthode pour utiliser la cytométrie multiparale de flux pour détecter les espèces réactives d'oxygène mitochondriales (ROS) dans les cellules hématopoïétiques et progénitrices saines murines (HSPc) et les cellules de leucémie d'un modèle de souris de leucémie myéloïde aigue (AML) conduit par MLL-AF9.

Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9

Nous présentons deux protocoles de souillure différents pour la détection du ligand NKG2D (NKG2DL) dans les échantillons humains primaires de leucémie myéloïde aiguë (AML). La première approche est basée sur une protéine de fusion, capable de reconnaître tous les ligands connus et potentiellement encore inconnus, tandis que le second protocole repose sur l’ajout de plusieurs anticorps anti-NKG2DL.

Deux approches cytométriques en flux de détection de surface de ligand NKG2D pour distinguer les cellules souches des sous-populations en vrac dans la leucémie myéloïde aiguë

Ici, nous décrivons un protocole dans lequel un modèle de xénogreffe dérivée d’un patient atteint de leucémie lymphoblastique aiguë est utilisé comme stratégie pour évaluer et surveiller les toxicités associées aux lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique CD19.

Évaluation des toxicités associées aux lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique à l’aide d’un modèle murin xénogreffé dérivé d’un patient atteint de leucémie lymphoblastique aiguë

Nous avons utilisé la coloration de prolifération cellulaire pour identifier les cellules quiescentes dans le modèle de leucémie lymphoblastique aiguë T-poisson zèbre. La coloration est conservée dans les cellules non divisées et réduite pendant la prolifération cellulaire, ce qui permet de sélectionner les cellules dormantes pour une interrogation plus approfondie. Ce protocole fournit un outil fonctionnel pour étudier l’auto-renouvellement dans le contexte de la quiescence cellulaire.

Identification de cellules quiescentes dans un modèle de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T de poisson-zèbre à l’aide de la coloration de la prolifération cellulaire 

Ce protocole fournit des instructions étape par étape pour la génération et le dépannage de xénogreffes de leucémie lymphoblastique aiguë (LAL) humaine à partir de lignées cellulaires et de matériel de patient frais dans des embryons de poisson-zèbre immunodéprimés transitoirement, ainsi que des directives pour l’évaluation de la réponse médicamenteuse à l’aide de la cytométrie en flux. Le pipeline expérimental peut également être adapté aux tumeurs solides.

Prédiction rapide de la réponse médicamenteuse in vivo à l’aide de greffes de cellules leucémiques dans des embryons de poisson-zèbre

Ce protocole décrit la xénogreffe in ovo de cellules de leucémie lymphoblastique aiguë (LAL) B et T dérivées de patients, qui se produit 4 jours après l’injection.

À Ovo Xénogreffe de cellules de leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) dérivées de patients (PDX-LAL)

Cette vidéo montre la procédure pour différencier les cellules dendritiques myéloïdes de la moelle osseuse de souris. Isolement du tibia et du fémur de souris, et le traitement de la moelle osseuse sont démontrés. Photos montrant la morphologie des cellules avant et après différenciation, et les chiffres illustrant phénotype cellulaire et la maturation de production d'IL-12 suivantes à l'aide CpG sont affichés.

Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Apprenez la cytométrie phosphoflow intracellulaire pour analyser les voies de signalisation mTORC1, JAK/STAT5 et MAPK dans les cellules de leucémie myéloïde aiguë dérivées de xénogreffes de patients.

Cytométrie phosphoflow intracellulaire des xénogreffes dérivées de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë

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