Cytométrie phosphoflow intracellulaire des xénogreffes dérivées de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë

Notre recherche vise à comprendre comment la leucémie myéloïde aiguë développe une résistance aux traitements approuvés. Basé sur l’hypothèse que le métabolisme joue un rôle clé. Le but ultime est d’identifier une stratégie qui peut surmonter efficacement cette résistance. La cytométrie en flux, largement utilisée dans la recherche sur la leucémie, est idéale pour analyser les cellules en suspension comme les cellules leucémiques. Son adaptabilité en fait un outil puissant pour les mécanismes moléculaires de données. Le principal défi expérimental de la recherche sur la LMA est de développer un protocole in vivo optimal pour la revitalisation moléculaire, c’est-à-dire la cellule pour une modélisation précise, la compréhension du mécanisme sous-jacent à la résistance thérapeutique.

[Narrateur] Pour commencer, pliez le genou de la souris et utilisez la main non dominante pour immobiliser la jambe afin d’exposer la surface articulaire du fémur où se trouve le côté de la perforation. Placez le pouce sur le tibia, l’index sur le fémur et le majeur sur la face externe des os pour les stabiliser. Tout en maintenant l’immobilisation, désinfectez la zone du genou avec de l’alcool isopropylique pour écarter les cheveux restants et améliorer la visualisation de la structure osseuse. À l’aide de la première seringue sèche de calibre 25, positionnez l’aiguille au milieu de l’articulation du fémur et faites-la pivoter doucement pour créer un trou dans la surface articulaire fémorale sans appliquer de force. Une fois que l’aiguille est entrée dans la moelle, retirez progressivement la seringue tout en la tournant. Insérez la deuxième seringue rincée dans le trou créé par la première aiguille. Appliquez le vide sur la deuxième seringue insérée dans le fémur tout en la tournant doucement et en la retirant progressivement. Transférez la moelle osseuse extraite en rinçant le contenu de la seringue dans un microtube à centrifuger réfrigéré contenant 500 microlitres de PBS. Conservez l’échantillon sur de la glace. Appliquez une légère pression sur le site de ponction à l’aide d’un écouvillon d’isopropanol pendant 30 secondes pour arrêter tout saignement. Centrifugez les cellules à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’un système d’aspiration intra-utérine, aspirez doucement et jetez le surnageant. Ajouter 200 microlitres par échantillon de solution de coloration cellulaire fluorescente. Dilué un à 100 dans du PBS pour marquer les cellules mortes. Remettez doucement les cellules en suspension à l’aide d’une pipette. Incuber ensuite les cellules sur de la glace pendant 10 minutes, à l’abri de la lumière. Après 10 minutes, centrifugez les cellules à 500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez et jetez le surnageant à l’aide d’un système de vide, ajoutez 100 microlitres par échantillon d’anticorps ultraviolets brillants HCD 45 395 dilués à un à 100 dans du PBS contenant 2 % de sérum fœtal bovin pour marquer les cellules hématopoïétiques humaines. Incuber les cellules sur de la glace pendant 15 minutes, en veillant à ce qu’elles soient protégées de la lumière. Centrifugez les cellules à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez et jetez le surnageant à l’aide d’un système de vide. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de formaldéhyde à 1,6 % dans une solution de PBS. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes, à l’abri de la lumière. Après 10 minutes, centrifugez les cellules à 500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez et jetez le surnageant à l’aide d’un système de vide. Ajoutez maintenant un millilitre de méthanol à 100 %, pré-refroidi à moins 20 degrés Celsius directement dans les deux. Incuber les échantillons à moins 20 degrés Celsius pendant 30 minutes à l’abri de la lumière. Centrifugez les cellules à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’un système d’aspiration, aspirez et jetez le surnageant. Ajoutez 50 microlitres de solution mixte d’anticorps ou de solution mixte de contrôle d’isotype à chaque échantillon. Remettez doucement les cellules en suspension à l’aide d’une pipette, incubez tous les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius, en veillant à ce qu’ils soient protégés de la lumière. Ensuite, centrifugez les cellules à 500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, lavez les cellules avec 1000 microlitres de PBS en les remettant doucement en suspension à l’aide d’une pipette. Centrifugez à nouveau les cellules à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, effectuez un deuxième lavage à l’aide de 1000 microlitres de PBS et remettez doucement les cellules en suspension à l’aide d’une pipette avant de centrifuger à nouveau les cellules à quatre degrés Celsius. Après avoir aspiré le surnageant, remettre en suspension les échantillons finaux dans 200 microlitres de PBS. Cette figure illustre le flux de travail, la stratégie de contrôle et la normalisation des signaux intracellulaires de la phosphoprotéine dans les cellules de la moelle osseuse de souris xénogreffes dérivées de patients atteints de leucémie myéloïde aiguë traitées avec un traitement à base de vénétoclax pendant 15 jours. La stratégie de déclenchement a permis d’identifier des cellules viables de leucémie myéloïde aiguë humaine ou LMA sur la base des profils de diffusion directe et latérale et de la positivité de CD45, ce qui a permis une analyse cohérente dans tous les groupes de traitement. Le traitement par le vénétoclax 5-azacitidine et l’uridine CDZ ont entraîné une augmentation de la phosphorylation de STAT5 et RPS6 dans les cellules LMA, suggérant l’activation des voies de survie associées à la résistance. Fait intéressant, lorsque les souris ont été traitées avec du giltéritinib, le traitement n’a pas réduit de manière significative la phosphorylation des protéines de la voie FLT3, ce qui indique que la signalisation a persisté malgré le traitement ciblé. STAT5 phosphorylé et RPS6 phosphorylé ont montré la plus forte augmentation de corrélation des niveaux d’expression après un traitement à base de vénétoclax, indiquant une co-activation de ces voies.