Outil réutilisable d’imagerie hépatique : un outil réutilisable imprimé en 3D pour la microscopie intravitale hépatique

L’objectif global de cette procédure est de mettre en avant l’Outil d’Imagerie Hépatique Réutilisable, ou RHIT, comme un outil révolutionnaire pour recueillir des données biologiques dynamiques et de haute qualité, notamment dans la recherche hépatique. Les méthodes scientifiques traditionnelles pour étudier les souris dans des expériences contrôlées reposent depuis longtemps sur l’observation comportementale, la surveillance physiologique et l’analyse génétique. La complexité de ces études entraîne souvent des résultats de données incohérents ou limités.

De nombreuses expériences reposent sur des données soit incomplètes, soit difficiles à interpréter, comme de brefs flashs d’images à faible résolution qui s’estompent rapidement, rendant difficile la capture de tendances à long terme ou de changements subtils. Introduction du RHIT, permettant une capture dynamique et haute résolution pour la recherche hépatique et au-delà. La technique que nous démontrons permet la fabrication d’outils d’imagerie personnalisés à partir de matériaux accessibles et d’une technologie d’impression 3D largement disponible.

Conçue pour être utilisée dans des environnements académiques et aux ressources limitées, cette approche permet le développement et le déploiement rapides de dispositifs permettant l’imagerie in vivo à haute résolution. Notre outil d’imagerie hépatique réutilisable, ou RHIT, a été développé pour améliorer la stabilité des tissus lors de la microscopie intravitale du foie. La conception modulaire de RHIT accueille des souris de différentes tailles et permet une imagerie étendue des processus métaboliques dynamiques avec un minimum de perturbations physiologiques.

Le RHIT est fabriqué en une seule étape à l’aide d’acrylonitrile, butadiène, styrène, ABS, un thermoplastique choisi pour sa légèreté, sa thermostabilité et sa durabilité mécanique. En ajustant la densité des matériaux, la RHIT absorbe efficacement les mouvements causés par la respiration et le battement du cœur, réduisant ainsi les artefacts d’image et améliorant la clarté. L’inertité chimique et l’insolubilité dans l’eau de l’ABS garantissent la disponibilité avec les tissus biologiques et permettent un nettoyage et une réutilisation efficaces.

Pour recréer RHIT, utilisez un logiciel de conception produit 3D. Autodesk Inventor a été utilisé pour cette conception. Ouvrez Autodesk Inventor et créez une nouvelle pièce standard.

Sauvegardez le fichier avec la description appropriée. Créez le croquis de RHIT sur le plan avant en utilisant la fonction création d’esquisse 2D. Cliquez sur l’icône rectangulaire et placez son coin inférieur gauche à l’origine du plan de croquis.

Dessinez un second rectangle à l’intérieur du premier pour représenter la fenêtre d’imagerie de RHIT. Ajoutez des dimensions aux deux rectangles en utilisant la fonction dimension, en veillant à ce que toutes les longueurs et largeurs soient référencées à l’origine et relatives les unes aux autres. Ajustez les dimensions RHIT en fonction de la taille de la souris.

Ajoutez de l’épaisseur à la RHIT en sélectionnant uniquement le rectangle extérieur et extrudez le croquis avec l’outil d’extrusion pour laisser une ouverture au centre. Sélectionnez la face inférieure du RHIT extrudé et commencez un nouveau croquis 2D en utilisant la fonction de démarrage du croquis 2D. Dessinez un rectangle pour définir la poche du coussin chauffant.

Définissez les dimensions du rectangle en fonction de la taille et de l’épaisseur de la bouillotte qui sera insérée dans cette fente. Ces mesures doivent correspondre à la bouillotte physique à utiliser afin d’assurer une modélisation précise de la température du mammifère. Appliquez les dimensions requises en utilisant la fonction dimension.

Sortez du croquis 2D et effectuez un retrait de matériau à l’aide de l’outil d’extrusion coupée pour créer une cavité profonde pour la bouillotte. Zoomez au besoin pour positionner précisément le croquis. Commencez un nouveau croquis pour la sonde de température sur la même face que la cavité.

Cliquez sur lancer un croquis 2D et sélectionnez l’icône cercle. Placez le cercle sur la surface plane et dimensionnez en conséquence. Sors du mode esquisse.

Cliquez sur extruder et sélectionnez le croquis du cercle. En mode extrusion, cliquez sur coupe, extrudez et retirez la matière. Placez le cercle sur le côté droit de la face avec l’insert de poche.

Il n’est pas nécessaire d’être centré pour l’instant. Ajoutez des dimensions pour l’aligner avec le centre de l’épaisseur du RHIT. Cliquez sur extrusion.

Une fenêtre pop-up apparaîtra avec une flèche indiquant la direction de la coupe, ainsi que l’option « traverser tout ». Sélectionnez à travers tout pour couper à travers tout le matériau, puis cliquez sur ok. Sortie du mode extrusion.

Ajoutez des filets sur les bords de la fenêtre en cliquant sur l’icône du filet et sélectionnez les huit bords tranchants. Ajoutez la taille du filet et sortez du mode filet. Préparez le modèle pour l’impression 3D en allant dans l’onglet environnement et en sélectionnant l’onglet impression 3D.

Pour imprimer le RHIT non modifié, importez le fichier STL, soit à partir de la figure 1A soit des matériaux supplémentaires, dans le logiciel de préparation à l’impression 3D A. Cliquez sur importer, sélectionnez le fichier, puis cliquez sur préparer pour découper le modèle en calques imprimables. Choisissez une imprimante 3D commerciale compatible et cliquez sur imprimer.

Surveillez le processus d’impression. Une fois terminé, retirez soigneusement et nettoyez le RHIT imprimé si besoin. Attendez 10 à 15 minutes après les éjections avant de commencer l’opération et l’imagerie.

Préparation au microscope et utilisation du RHIT. Préparez un microscope confocal inversé conventionnel pour l’IBN hépatique, comme montré à la figure 2A. Insérez l’adaptateur de scène pour l’échantillon.

Pour ce protocole, un insert métallique sur mesure a été utilisé avec une ouverture circulaire de 35 millimètres et un verre de couvercle de 40 millimètres. Nettoyez soigneusement les deux côtés du verre de couverture avant et après l’imagerie, en utilisant 70 % d’éthanol si nécessaire. Fixez le RHIT approprié en fonction de la taille de la souris avec du ruban adhésif en alignant l’ouverture RHIT avec la lentille objective, parallèlement à la gaine de recouvrement d’imagerie, comme montré à la figure 2G, sur l’insert métallique avec du ruban au-dessus du verre de la couverture.

Sélectionnez l’objectif pour l’imagerie en fonction de la taille de la zone, de la résolution spatiale et du temps d’imagerie, par exemple un objectif d’eau 25X par 95. Nivelez l’objectif près de la vitre de couverture. Fixez une bande de gaze sur la fenêtre humide avec du ruban adhésif.

Cela aidera à positionner le tissu et à le séparer des autres organes abdominaux. Préchauffez la RHIT à l’aide d’un coussin chauffant inséré dans la fente et fixez la sonde thermique à côté de la RHIT, comme le montrent les figures 2G à H. Cela maintiendra la température corporelle de la souris lors de l’imagerie. Rase la veste abdominale à l’aide d’une tondeuse et/ou d’une crème dépilatoire.

Retirez les résidus de cheveux et désinfectez la peau exposée avec 70 % d’éthanol. Selon les exigences institutionnelles de l’IACUC, un frottement alterné de Bétadine et d’éthanol peut être utilisé pour assurer une préparation appropriée du site chirurgical. Réévaluez la profondeur de l’anesthésie avant l’opération sur l’animal.

Exposez le foie en réalisant une incision horizontale en forme de croissant de deux à trois centimètres sous la cage thoracique avec des ciseaux chirurgicaux depuis le xiphoïde, se terminant sur le côté latéral gauche du haut de l’abdomen. Après l’incision initiale, réalisez soigneusement une incision secondaire plus petite dans la couche musculaire pour exposer le lobe gauche du foie. Cauterisez au besoin pour éviter les saignements.

Prévenez les dommages causés par la chaleur au foie en utilisant le cautérisant en plaçant une gaze imbibée de solution saline entre le foie et la couche musculaire pour absorber la chaleur émanante du muscle. Évitez tout saignement excessif, un traumatisme chirurgical ou mécanique, ou une compression externe. Une fois le foie exposé, transférer la souris sur l’étage du microscope.

Positionnement de la souris sur l’étage du microscope. Placez l’abdomen de la souris anesthésiée face vers le bas sur la plateforme RHIT du microscope. Ajustez le cône du nez pour que la souris reste sous anesthésie.

Utilisez un applicateur à extrémité de coton imbibé de solution saline pour guider doucement le lobe latéral gauche du foie contre la housse de couverture tout en appliquant une pression externe sur la cavité thoracique. Profitez de la gravité pour déplacer prudemment le foie vers l’extérieur et le poser sur la vitre de recouvrement. Utilisez une bande de gaze pour séparer doucement le foie du corps de la souris.

Vérifiez à nouveau le cône du nez pour vous assurer que la souris reste sous anesthésie lors de l’imagerie. Prévenez la déshydratation des tissus en appliquant un gel à base d’eau autour des bords de la cavité exposée et en évitant le contact direct avec la bouillotte. Un microscope avec une chambre d’humidité fermée peut également aider à maintenir la température et l’humidité.

Appliquez une pommade optalmique sur les yeux pour éviter le dessèchement cornéen. Enfin, mettez en place une IVM en accéléré pour commencer l’imagerie. Ouvrez les obturateurs laser, évaluez le marquage fluorescent et identifiez une région stable d’intérêt avec un flux sanguin notable.

Sélectionnez les acquisitions d’images appropriées, y compris le format, la vitesse, les intervalles d’image, la durée de temps, la moyenne d’images, etc. Définir la limite supérieure et inférieure pour les Z-stacks si nécessaire, et commencer l’enregistrement en accéléré. Pour valider notre protocole, nous avons quantifié la stabilité de l’image à l’aide de l’indice de similarité structurelle, ou SIM, illustré à la figure 3D.

SIM compare deux images en fonction de la luminance, du contraste et des motifs structurels. Une valeur de un indique une similarité parfaite, tandis que zéro reflète une distorsion. La figure 3C montre que RHIT produit systématiquement les valeurs SIM les plus élevées, jusqu’à 50 fois supérieures à l’absence d’insertion, démontrant une qualité d’image supérieure.

Sur les images intitulées A à C, nous avons comparé la FIV hépatique sans stabilisateur, avec le carton en insertion, et avec la RHIT. La RHIT maintient une résolution claire des gouttelettes lipidiques dans le magenta, des noyaux en vert et des vasculaires dans le cyan. Les inserts en noir et blanc mettent en valeur la stabilité de l’image.

RHIT a également permis l’IBM à long terme sur des souris obèses pendant plus de huit heures, comme montré dans le premier film. Ensemble, ces résultats ont confirmé que le RHIT améliore significativement la qualité et la reproductibilité de l’imagerie dans toutes les conditions. Pris ensemble, RHIT simplifie la configuration complexe traditionnellement requise pour l’IBM hépatique, améliorant à la fois la reproductibilité et l’accessibilité.

Cette approche anticipe un mouvement plus large vers l’exploitation de l’impression 3D pour la standardisation de protocoles d’imagerie avancés. Au-delà de l’imagerie hépatique, les principes de conception du RHIT peuvent être étendus à d’autres applications, notamment la tomographie d’organes, la science des matériaux et l’ingénierie, où la stabilité du mouvement est essentielle à la fidélité de l’image.