Fabrication reproductible de SPOT en tant que plate-forme de culture à haut débit basée sur un échafaudage

Nos recherches se concentrent sur le développement de plateformes à haut débit, soutenues par des échafaudages, pour des cultures orgonomiques robustes, reproductibles et dérivées de patients, afin d’améliorer le flux de travail des tests de dépistage de médicaments et de contribuer à la modélisation avancée des maladies.

Les manipulateurs de liquides automatisés, les plates-formes d’hydrogel soutenues par des échafaudages, les technologies d’organes sur puce et les tests unicellulaires tels que la cytométrie en flux et les CYTOP sont quelques-unes des technologies actuellement disponibles.

Les défis actuels comprennent la préservation de l’intégrité de l’hydrogel, le dépassement du ménisque en gel pour l’imagerie en temps réel et la garantie d’une distribution cellulaire uniforme dans les tests à long terme basés sur des organoïdes.

Notre protocole permet une charge cohérente de l’hydrogel soutenue par un échafaudage, minimise les problèmes de ménisque, prend en charge la culture d’organoïdes à long terme et s’intègre en douceur aux manipulateurs de liquides automatisés et au système d’imagerie à haut contenu.

Nous sommes très enthousiastes à l’idée d’utiliser nos plateformes de modélisation des maladies pour explorer les mécanismes de progression de la maladie dans le cancer et le développement de l’obésité.

[Instructeur] Pour commencer, prenez un échafaudage en PMMA pour 96 ou 384 SPOT. Coupez l’excédent de papier autour de la région bleue de l’échafaudage, en laissant une marge blanche de cinq millimètres autour du périmètre. Assurez-vous que la feuille résultante mesure environ 760 millimètres sur 1 300 millimètres. Pour préparer un échafaudage 96 SPOT pour le montage, posez un morceau de film de polyéthylène sur un support acrylique rigide. Placez ce support recouvert d’un film sur le plan de travail et posez l’échafaudage sur le film de polyéthylène. Alignez le bord d’une règle entre les deux premières rangées de l’échafaudage pour éviter de tracer dans les puits. Placez la roue de traçage au bas de l’échafaudage et roulez-la vers le haut, guidée par la règle. Pour un échafaudage 384 SPOT, ne pas effectuer de perforation. Ensuite, posez l’échafaudage avec le côté rugueux vers le haut sur une dalle PDMS, en veillant à ce que les rangées soient horizontales. Utilisez la ligne d’apprêt pour déterminer quel côté est rugueux, puis lissez l’échafaudage sur la dalle pour éliminer les plis ou les bulles. Retirez la couche protectrice du côté non gravé du ruban adhésif double face. Bouclez légèrement le ruban au milieu et alignez les deux colonnes centrales du ruban avec l’échafaudage. Maintenant, appuyez le milieu du ruban sur l’échafaudage pour sécuriser l’alignement. Lissez le ruban vers l’extérieur à partir du centre pour le fixer uniformément. À l’aide d’une pince à épiler, soulevez doucement l’échafaudage de la dalle PDMS. Stockez la dalle pour une utilisation future. Pour fixer l’échafaudage au ruban de deuxième puits, retournez l’échafaudage de sorte que le côté lisse et non collé soit tourné vers le haut sur l’établi. Retirez la couche protectrice intermédiaire du côté gravé du deuxième ruban pour exposer deux colonnes centrales. Bouclez légèrement le milieu du deuxième ruban et alignez-le sur les colonnes centrales de l’échafaudage, puis appuyez sur le centre du ruban pour le fixer en place. Si vous utilisez du ruban gravé, retirez les couches protectrices restantes adjacentes au centre exposé. Lissez le ruban, en commençant par le milieu et en allant vers l’extérieur. Pour fixer l’échafaudage à la plaque sans fond, retirez la couche protectrice. Alignez l’échafaudage sous la plaque sans fond avec un couvercle. Une fois aligné, appuyez sur son milieu sur la plaque. Si vous utilisez du ruban gravé, retirez les couches adjacentes et lissez l’échafaudage sur la plaque vers l’extérieur à partir du centre. Pour fixer l’échafaudage au film de polycarbonate, utilisez une pince à épiler pour détacher soigneusement la couche protectrice d’un côté du film de polycarbonate, puis décollez lentement la couche de protection sans provoquer d’indentations dans le film. Répétez le processus pour le deuxième côté, puis mettez le film de côté sur l’établi. Décollez la couche de ruban de protection du fond de la plaque et appuyez le film de polycarbonate sur l’échafaudage du centre vers l’extérieur. Ensuite, appuyez fermement le film de polycarbonate sur l’échafaudage pour vous assurer que chaque puits a une bordure définie. À l’aide d’un couteau de précision, coupez soigneusement tout excès de matériau du bas de la plaque. Une fois l’assemblage complet, placez la plaque 96 SPOT dans un sac en plastique transparent et refermable et sortez-la de l’enceinte de biosécurité. Placez un support en acrylique rigide sous la plaque et fixez les deux aux coins opposés. Rangez la plaque dans un endroit propre et sec jusqu’à ce qu’elle soit utilisée ultérieurement. Aucune fuite ou échange de fluide n’a été observé lorsque les puits alternés de la plaque 384 SPOT ont été remplis de fluorescéine et de PBS pendant une période d’essai de 30 jours, ce qui confirme l’efficacité de la barrière en PMMA pour maintenir l’isolement de puits à puits. Les organoïdes tumoraux pancréatiques exprimant la GFP ensemencés dans 96 plaques SPOT sont restés viables et se sont développés progressivement du jour zéro au jour 12 de la culture. Au jour 12, les organoïdes cultivés par SPOT ont montré une forte expression de la cytokératine 19 et de Zonula Occludens-1, ainsi que la présence de structures de lumière interne. Les résultats d’ensemencement tissulaire sous-optimaux et optimaux dans 384 plaques SPOT ont été distingués visuellement par la définition des bords et l’uniformité de la distribution cellulaire. Le manipulateur de liquides automatisé a permis d’obtenir un semis uniforme sur l’ensemble des plaques 96 SPOT et 384 SPOT.