Name: Biocapteurs de protéine G à base de BRET pour mesurer l’activité des récepteurs couplés aux protéines G dans des cellules vivantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Découvrez l'utilisation de biocapteurs BRET pour mesurer l'activation des protéines G dans des cellules HEK293 vivantes. Cette méthode permet d'étudier en temps réel la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G.

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<ol><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+as+targets+for+approved+drugs%3A+How+many+targets+and+how+many+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs.</a> Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+%28GPCRs%29%3A+Advances+in+structures%2C+mechanisms%2C+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors (GPCRs): Advances in structures, mechanisms, and drug discovery.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 1-43 (2024).</li>
<li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">protein pathways.</a> Science. 296 (5573), 1636-1639 (2002).</li>
<li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+the+G+protein+Gs+induced+by+the+%CE%B22+adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor.</a> Nature. 477 (7366), 611-617 (2011).</li>
<li>Hepler, J. R., Gilman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">G proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 17, 383-387 (1992).</li>
<li>Van Unen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+FRET+sensors+for+robust+measurement+of+G%CE%B1i1%2C+G%CE%B1i2+and+G%CE%B1i3+activation+kinetics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new generation of FRET sensors for robust measurement of Gαi1, Gαi2 and Gαi3 activation kinetics in single cells.</a> PLoS One. 11 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).</li>
<li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2411 (2001).</li>
<li>Galés, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+activation-promoted+structural+rearrangements+in+preassembled+receptor-G+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the activation-promoted structural rearrangements in preassembled receptor-G protein complexes.</a> Nat Struct Mol Biol. 13 (9), 778-786 (2006).</li>
<li>Schihada, H., Shekhani, R., Schulte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+constitutive+G+protein-coupled+receptor+activity+with+BRET-based+G+protein+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of constitutive G protein-coupled receptor activity with BRET-based G protein biosensors.</a> Sci Signal. 14 (699), eabf1653(2021).</li>
<li>Zhou, Y., Meng, J., Xu, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+GPCR+functional+assays+based+on+resonance+energy+transfer+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple GPCR functional assays based on resonance energy transfer sensors.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 611443(2021).</li>
<li>Scott-Dennis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+membrane-based+Gi-CASE+biosensor+assay+for+profiling+compounds+at+cannabinoid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a membrane-based Gi-CASE biosensor assay for profiling compounds at cannabinoid receptors.</a> Front Pharmacol. 14, 1158091(2023).</li>
<li>Violin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+signaling+and+desensitization+elucidated+by+quantitative+modeling+of+real-time+cAMP+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real-time cAMP dynamics.</a> J Biol Chem. 283 (5), 2949-2961 (2008).</li>
<li>Scarpace, P. J., O'Connor, S. W., Abrass, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+and+isoproterenol+modulation+of+beta-adrenergic+receptor+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Temperature and isoproterenol modulation of beta-adrenergic receptor characteristics.</a> Life Sci. 38, 309-315 (1985).</li>
<li>Thomas, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+receptor+binding+analyses+of+cannabinoid+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative receptor binding analyses of cannabinoid agonists and antagonists.</a> J Pharmacol Exp Ther. 285 (1), 285-292 (1998).</li>
<li>Schihada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+GPR35+have+distinct+extracellular+N-termini+that+allosterically+modify+receptor-transducer+coupling+and+mediate+intracellular+pathway+bias%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isoforms of GPR35 have distinct extracellular N-termini that allosterically modify receptor-transducer coupling and mediate intracellular pathway bias.</a> J Biol Chem. 298 (9), 102328(2022).</li>
</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6664">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68463">10.3791/68463</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68463">BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells

<table><tbody><tr><td>Plaque de culture avancée à 96 puits, blanche avec fond plat transparent, avec couvercle, Greiner bio-one</td><td>Dutscher</td><td>655983</td><td></td></tr><tr><td>Film blanc BrightMax ClearLine</td><td>Dutscher</td><td>760245</td><td></td></tr><tr><td>ClarioSTAR LVF</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>DPBS modifié, sans chlorure de calcium ni chlorure de magnésium, liquide, filtré stérile, adapté à la cellule</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco » s modifié Eagle' s medium (DMEM) GlutaMAX</td><td>Sigma</td><td>D0822</td><td>Il fait chaud à 37 °C Bain marie en C avant utilisation</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Galphai3-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-Vénus</td><td>Addgene</td><td>168122</td><td>https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ Don de Gunnar Schulte</td></tr><tr><td>Galphas (isoforme courte)-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-Vénus</td><td>Addgene</td><td>168124</td><td>https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ Don de Gunnar Schulte</td></tr><tr><td>HEK-293T exprimant de manière stable CB1R (HEK CB1)</td><td></td><td></td><td>Cadeau généreux de M. Guzman (Université Complutense, Madrid, Espagne)</td></tr><tr><td>HEK-293T de type sauvage (HEK wt)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoprotérénol</td><td>Sigma</td><td>I6504</td><td>Solubilisé dans H20 et stocké à &ndash ; 20 & degrés C</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I complément sérique réduit medium GlutaMAX</td><td>Fischer</td><td>11564506</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3 Flag tag bêta-2-récepteur adrénergique FLAG C-ter</td><td></td><td></td><td>Généreux don de D. Perrais (IINS, Bordeaux)</td></tr><tr><td>pcDNA3.1-(vide)-TAG</td><td>Addgene</td><td>138209</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solution de poly-L-lysine (PLL)</td><td>Sigma</td><td>RNBL7086</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA & nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>VICTOIRE : 55 212-2</td><td>Cayman Chemicals</td><td>10009023</td><td>Solubilisé dans le DMSO et stocké à &ndash ; 20 & degrés C</td></tr></tbody></table>

biocapteurs de protéine g à base de bret pour mesurer l’activité des récepteurs couplés aux protéines g dans des cellules vivantes

BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells

Biocapteurs de protéine G à base de BRET pour mesurer l’activité des récepteurs couplés aux protéines G dans des cellules vivantes

G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of transmembrane receptors, playing a crucial role in cellular signaling by transducing ...

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Ici, nous décrivons les méthodes détaillées direct imagerie cellulaire pour enquêter sur le chimiotactisme. Nous présentons la fluorescence des méthodes microscopiques pour surveiller la dynamique spatio-temporelle des événements de signalisation dans les cellules en migration. Mesure des événements de signalisation nous permet de mieux comprendre comment un réseau de signalisation GPCR réalise gradient de détection et de contrôle des chimiotactiques migration directionnelle des cellules...

Récepteur d&#39;imagerie couplés aux protéines G (RCPG) à médiation événements de signalisation qui contrôle chimiotactisme des Dictyostelium discoideum</em

Nous génétiquement coder l'acide aminé non naturel, p-azido-L-phénylalanine à divers postes ciblés dans les RCPG et de montrer la polyvalence du groupe azido dans différentes applications. Ceux-ci comprennent une technologie de photoréticulation ciblée pour identifier des résidus dans la poche de liaison au ligand d'un GPCR, et spécifique à un site de modification bioorthogonal GPCR avec un peptide marqueur d'épitope ou une sonde fluorescente.

Molecular Probes génétiquement codés pour étude g récepteurs couplés à la protéine

Techniques de biocapteurs optiques peuvent détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique dans les cellules vivantes et permettre un suivi de la réponse cellulaire dans les deux cellules et les populations de cellules individuelles. Ce protocole décrit la détection de la modulation des canaux potassiques par G récepteurs couplés aux protéines dans des cellules intactes en utilisant cette approche.

L&#39;utilisation de biocapteurs optiques sans étiquette pour détecter la modulation de potassium par les canaux G récepteurs couplés aux protéines

L'essai de mobilisation du calcium par fluorescence ici décrit est un système de criblage inverse pharmacologie à débit moyen pour l'identification de ligand (s) d'activation fonctionnellement G orphelins de récepteurs couplés aux protéines (RCPG).

Caractérisation des récepteurs de protéines G couplées par une mobilisation de calcium dosage à base de fluorescence

Des méthodes simples pour détecter l’activation sélective des protéines G par les récepteurs couplés aux protéines G restent un défi majeur dans la signalisation cellulaire. Ici, des biocapteurs de transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) ont été développés en attachant par paires un RCPG à des peptides de protéine G pour sonder les changements de conformation à des concentrations contrôlées dans des cellules vivantes.

Conformations GPCR G Protein-sélectifs mesurée à l&#39;aide de FRET capteurs dans un Fluorometer Assay de cellules vivantes de suspension

La liaison à la guanosine triphosphate (GTP) est l'un des premiers événements dans l'activation du récepteur couplé aux protéines G (GPCR). Ce protocole décrit comment caractériser pharmacologiquement des interactions spécifiques de GPCR-ligand en surveillant la liaison de l'analogue GTP radio-marqué, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), en Réponse à un ligand d'intérêt.

Mesure de la signalisation des récepteurs couplés à la protéine G via liaison GTP radiomarquée

Les interactions GPCR-MD-arrestin sont un domaine émergent dans la découverte de médicaments par gpCR. Des méthodes précises, précises et faciles à mettre en place sont nécessaires pour surveiller de telles interactions dans les systèmes vivants. Nous montrons un test de complémentarité structurelle pour surveiller les interactions GPCR-MD-arrestin dans les cellules vivantes en temps réel, et il peut être étendu à n'importe quel GPCR.

Surveillance des interactions GPCR-MD-arrestin1/2 dans les systèmes de vie en temps réel pour accélérer la découverte de médicaments

Étant donné que les RPGC sont des cibles médicamenteuses attrayantes, le dépistage du ligand GPCR est donc indispensable pour l’identification des composés de plomb et pour les études de désorphanisation. À l’égard de ces efforts, nous décrivons PRESTO-Tango, une plate-forme de ressources open-source utilisée pour le profilage simultané du recrutement transitoire d’un PGS2 à environ 300 GPCR à l’aide d’un essai de journaliste basé sur TEV.

Interrogation parallèle du recrutement d'2-Arrestin2 pour le dépistage de Ligand sur une échelle GPCR-Wide utilisant PRESTO-Tango Assay

S1P exerce ses divers effets physiologiques à travers la sous-famille des récepteurs S1P (S1PR). Ici, un pipeline est décrit pour expliquer les structures et la fonction des S1PR.

Un pipeline pour étudier les structures et les voies de signalisation des récepteurs de la sphingosine 1-phosphate

Dans ce travail, un test de fluorescence calcique intracellulaire à haut débit pour des plaques à 384 puits afin de cribler de petites banques de molécules sur des récepteurs couplés aux protéines G recombinantes (RCPG) est décrit. La cible, le récepteur kinine de la tique de la fièvre bovine, Rhipicephalus microplus, est exprimée dans les cellules CHO-K1. Ce test identifie les agonistes et les antagonistes utilisant les mêmes cellules dans un test de « double addition ».

Un test de fluorescence calcique « à double addition » pour le criblage à haut débit de récepteurs couplés à la protéine G recombinante

Le protocole présenté dans cette étude illustre l’efficacité du détecteur de différence AMPc in situ  dans la mesure de l’AMPc à l’aide de deux méthodes. L’une des méthodes utilise un spectrophotomètre à lecture de plaques à 96 puits avec des cellules HEK-293. L’autre méthode permet de visualiser des cellules HASM individuelles au microscope fluorescent.

Dynamique de l’AMPc en temps réel dans les cellules vivantes à l’aide du détecteur de différence AMPc fluorescent in situ

Découvrez l'utilisation de biocapteurs BRET pour mesurer l'activation des protéines G dans des cellules HEK293 vivantes. Cette méthode permet d'étudier en temps réel la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G.

Biocapteurs de protéine G à base de BRET pour mesurer l’activité des récepteurs couplés aux protéines G dans des cellules vivantes (Vidéo) | JoVE Journal

Biocapteurs de protéine G à base de BRET pour mesurer l’activité des récepteurs couplés aux protéines G dans des cellules vivantes

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