Name: Sonde d’hybridation fendue utilisant un aptamère lumineux fluorescent d’ADN comme rapporteur de signal pour l’analyse d’acides nucléiques spécifiques à une séquence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Découvrez la conception de sondes d'hybridation fendues utilisant l'aptamère fluorescent DAP-10-42 pour détecter les substitutions de nucléotides uniques dans l'analyse des acides nucléiques.

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1. Conception du capteur Split-Up Aptamer Sensor (SLAS) avec DAP-10-42 comme rapporteur de signal
<ol>
	<li>Concevoir les séquences de deux brins d’oligonucléotides d’ADN non modifiés constituant les SLAS. Utilisez un fragment contenant les nucléotides (nts) 4,6-39 de DAP-10-42 (Tableau 1, Figure 1A).</li>
	<li>Convertissez la séquence de la tige 1 (nts 1-8 et 36-42) en tige 1' en retirant un résidu de thymine bombé à la position nt 5, en raccourcissant la tige à 4 pb (nts 4, 6-8 et 36-39) et en ajoutant une bp terminale C-G (Figure 1A, étape 1). De plus, l’un des brins SLAS contient les nts 9 à 29 de la séquence centrale DAP-10-42, tandis qu’un autre brin SLAS contient les nt 30 à 35 de la séquence.</li>
	<li>Étendre la séquence 3'-terminale du fragment contenant nts 9-29 avec d(GGTCAT), et la séquence 5'-terminale du fragment nts 30-35 avec d(ATGACC) pour former une tige 2 de 6-bp (Figure 1A, étape 2). REMARQUE : Les paires de bases T4-A39, A6-T38, C7-G37 et G8-C36 de la tige 1 dans DAP-10-42 sont nécessaires pour la fonction d’éclairage de l’aptamère. La séquence de la tige 1' ne peut être modifiée qu’au niveau de la borne bp et peut être une paire de bases G-C, A-T, T-A ou étendue avec 1-2 paires de bases selon les besoins. La séquence de la tige 2 est arbitraire et peut être modifiée. Cependant, il est recommandé de préserver la stabilité thermodynamique de la tige 2 à moins que la température d’essai ne soit supérieure à 28 °C. Le raccourcissement ou la déstabilisation de la tige 2 empêche la liaison prématurée du colorant sans cible si un bruit de fond élevé de l’essai fluorescent basé sur le SLAS est observé. La division de la séquence nucléotidique DAP-10-42 entre les nts 28-29, 27-28 ou 26-27 au lieu des nts 29-30 est également autorisée (Figure 1B).</li>
	<li>Pour adapter le SLAS conçu à une cible ou à un intérêt d’acide nucléique, étendez la tige 1' avec des séquences d’ADN complémentaires aux fragments de liaison cible-cible (bras) par l’intermédiaire de lieurs d(TT) (Figure 1A, étape 3). Cela donne les séquences de brins SLAS-U et SLAS-S constituant la sonde.</li>
	<li>Faire en sorte que le bras de liaison à la cible de SLAS-S soit complémentaire à un fragment de 7 à 10 nt de la cible contenant le site SNS, et que le bras de liaison à la cible de SLAS-U soit complémentaire à un fragment de 15 à 25 nt de la cible adjacent au bras de liaison à la cible de SLAS-S (tableau 1). REMARQUE : Il est facultatif de connecter le bras de liaison de cible de SLAS-S à nt 4 ou nt 39 de la séquence DAP-10-42 (Figure 1, bras 1 ou bras 2, respectivement).</li>
	<li>Évaluez la température de fusion (Tm) des duplex entre la cible d’intérêt et les bras de liaison de cible de SLAS-S et SLAS-U à l’aide du serveur Web UNAFold (unafold.org)19.<ol>
		<li>Cliquez sur l’onglet DINAMelt en haut de la page Web ; allez à Applications et sélectionnez Hybridation par fusion à deux états (Figure supplémentaire 3A). Sur la page Hybridation par fusion à deux états, entrez l’une des séquences en interaction dans la case de gauche et une autre dans la case de droite (Figure supplémentaire 3B). Assurez-vous que les deux séquences sont dans l’ordre de 5' à 3'. Vous pouvez saisir plusieurs paires de séquences en interaction en les séparant par des points-virgules.</li>
		<li>Au bas de la page, indiquez la température d’essai (22 °C), les concentrations en cations monovalents et divalents (20 mM et 25 mM, respectivement) pour correspondre aux conditions d’essai. Indiquez la concentration des séquences en interaction.</li>
		<li>Appuyez sur Soumettre (Figure supplémentaire 3B). Observez les résultats qui incluent la variation d’énergie de Gibbs, la variation d’enthalpie et la variation d’entropie de la liaison, ainsi que les valeurs Tm pour les duplex correspondants (figure supplémentaire 3B).</li>
		<li>Assurez-vous que les valeurs Tm des duplex entre la cible entièrement appariée (M) et les bras de liaison de cible de SLAS-S et SLAS-U sont supérieures à la température de test, qui est de 22 °C dans le protocole actuel. Ici, les valeurs Tm étaient respectivement de 32,2 °C et 74,4 °C (figure supplémentaire 3C).</li>
		<li>Assurez-vous que le duplex entre SLAS-S et une cible non appariée (MM) contenant un SNS a un Tm en dessous de la température de test. Cela garantit une grande sélectivité de la reconnaissance sonde-cible, empêchant le fluorogène AO de signaler la présence de l’analyte d’acide nucléique ciblé s’il contient un SNS dans le fragment de liaison SLAS (Figure 2). Ici, le Tm était de 21,3 °C (figure supplémentaire 3C), ce qui était suffisant pour distinguer le décalage du complexe apparié.</li>
		<li>Ajuster les séquences des bras de liaison de la cible en raccourcissant ou en allongeant les fragments complémentaires de la cible, si nécessaire, pour répondre aux exigences de stabilité indiquées.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procurez-vous les brins conçus SLAS-S et SLAS-U auprès de tout fournisseur commercial fournissant des oligonucléotides d’ADN sur mesure ou synthétisez les brins d’ADN en interne à l’aide d’un synthétiseur d’oligonucléotides automatisé.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig1.jpg"> 
Figure 1 : Conversion d’un aptamère lumineux fluorescent (FLAP) DAP-10-42 en un capteur d’aptamère lumineux divisé (SLAS). (A)La structure secondaire de DAP-10-4212 est prédite par une application de repliement de l’ADN du serveur Web UNAFold19 à 22 °C, 20 mM Na+, 25 mM Mg2+. L’aptamère présente une structure secondaire en épingle à cheveux avec un noyau qui se replie probablement en un motif G-quadruplex stabilisé par la tige 1. Pour que le DAP-10-42 soit converti en SLAS, (1) la tige 1 de l’aptamère est raccourcie à 4 pb et flanquée d’une tige G-C bp supplémentaire pour faire la tige 1' ; (2) la séquence centrale est divisée entre les NT 29 et 30, les côtés 3' et 5' du site divisé étant prolongés par des séquences complémentaires d(GGTCAT) et d(ATGACC), respectivement, pour former la tige 2 ; (3) la tige 1' est prolongée avec les séquences complémentaires aux fragments adjacents d’une cible d’intérêt - bras de liaison de cible, avec un liant d(TT) entre les bras de liaison de cible et le domaine de rapport de signal de la sonde. (B) Le noyau peut également être divisé entre les nts 28-29, 27-28 ou 26-27 sans perte significative du signal et/ou augmentation du pli de fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2.jpg"> 
Figure 2 : Mécanisme de génération de signal SLAS. SLAS est composé de deux brins - SLAS-U et SLAS-S - et d’un colorant fluorogène (p. ex., Auramine O ; AO). En l’absence d’une cible d’acide nucléique d’intérêt, les deux brins sont à l’état dissocié et incapables de lier le colorant ; Aucun signal n’est observé (centre). En présence d’une cible M entièrement appariée, SLAS-U et SLAS-S s’hybrident avec le fragment voisin de M pour rapprocher les fragments de cœur. Cela permet la formation du site de liaison du colorant. La liaison de l’AO améliore sa fluorescence, qui est mesurée sous la forme d’une lecture de signal fluorescent (à gauche). En présence d’un MM cible non apparié contenant une substitution mononucléotidique (SNS) dans un fragment interagissant avec SLAS-S, seul SLAS-U peut s’hybrider avec la cible MM, tandis que SLAS-S est à l’état dissocié. Cela empêche la formation du site de liaison du colorant, et aucun signal n’est observé (à droite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
2. Amplification de la séquence ciblée
<ol>
	<li>Amplifiez un fragment du gène à analyser avec le test SLAS. Pour l’amplification par PCR ou RPA, utilisez des conditions asymétriques (par exemple, avec l’amorce directe ajoutée à 10 fois l’excès par rapport à l’amorce inverse) pour générer un amplicon simple brin. Pour amplifier un fragment de 126 nt du gène NANOGP8 à l’aide de la PCR20 linéaire après l’exponentielle (LATE), utilisez les séquences d’amorces répertoriées dans le tableau 2. Ici, une matrice d’ADN simple brin (matrice NANOGP8 ou matrice G1423C, tableau 2) correspondant au fragment de 126 nt du gène a été utilisée. Le modèle a été synthétisé sur mesure par Integrated DNA Technologies, Inc.<ol>
		<li>Préparez une réaction PCR de 100 μL en mélangeant 10 μL de tampon de réaction Taq standard 10x, 2 μL de mélange dNTP de 10 mM (pour avoir une concentration finale de 0,2 mM), 10 μL d’amorce directe de 10 μM et 10 μL d’amorce inverse de 1 μM (pour une concentration finale de 1 μM et 0,1 μM, respectivement), 0,5 μL d’ADN polymérase 5U/μL Taq, de matrice d’ADN et d’eau sans nucléases. Pour un contrôle sans modèle, ajoutez de l’eau à la place du modèle.</li>
		<li>Utiliser les conditions de thermocyclage suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 1 min ; 45 cycles de (1) dénaturation à 95 °C pendant 15 s, (2) recuit d’apprêt à 60 °C pendant 30 s, (3) extension d’apprêt à 68 °C pendant 30 s ; et extension finale à 68 °C pendant 5 min. REMARQUE : Les techniques d’amplification basées sur la transcription telles que NASBA18 peuvent être utilisées à la place de la PCR ou de la RPA, surtout si une matrice d’ARN est disponible pour l’amplification. NASBA génère un amplicon d’ARN simple brin à une concentration de produit final de l’ordre des micromolaires, ce qui est suffisamment élevé pour être utilisé dans le test SLAS en aval sans concentration de produit.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Précipiter les échantillons amplifiés avec de l’éthanol en ajoutant 0,1 fois le volume d’acétate de sodium 3 M (pH 5,5) et 3 fois le volume d’éthanol. Incuber à -20 °C pendant 1 h, centrifuger à 12 000-18 000 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.</li>
	<li>Lavez la pastille avec de l’éthanol à 70 %, centrifugez-la à nouveau et jetez à nouveau le surnageant. Faites sécher la pastille à l’air libre et dissolvez-la dans 10 μL d’eau exempte de nucléases à utiliser dans le test SLAS.</li>
</ol>
3. Test de fluorescence à l’aide de SLAS
<ol>
	<li>Préparer des solutions mères d’AO (0,1 mM dans le DMSO, 10x), de SLAS-S (10 μM dans de l’eau sans nucléases, 10x), de SLAS-U (10 μM dans de l’eau sans nucléases, 10x) et de 4x tampon de dosage (80 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM MgCl2, 80 mM KCl). REMARQUE : Les ions potassium sont nécessaires pour stabiliser le motif présumé G-quadruplex de l’aptamère, qui fait partie du site de liaison du colorant. Aussi peu que 1 mM de KCl (à 25 mM MgCl2) dans un tampon de test 1x est suffisant pour assurer une augmentation de la fluorescence de ~14 fois en présence de la cible spécifique M sur le blanc (échantillon sans cible ; Figure supplémentaire 2B). Les ions magnésium stabilisent les interactions des brins d’acide nucléique (entre SLAS-S, SLAS-U et la cible). La concentration de Mg2+ dans le tampon de dosage 1x doit être d’au moins 5 mM (à 20 mM KCl ; Figure supplémentaire 2C,D). La solution mère d’AO (~1 mM) est préparée dans du DMSO. Les concentrations de stock de SLAS-S et de SLAS-U sont arbitraires et peuvent être ajustées si nécessaire tant que les concentrations finales des brins sont maintenues (voir la justification du choix de la concentration finale de SLAS dans la discussion). ATTENTION : L’AO est nocif en cas d’ingestion, toxique au contact de la peau et suspecté de provoquer le cancer. Portez toujours des gants lorsque vous travaillez avec des solutions AO. La pesée de l’AO et la préparation de ses solutions mères doivent se faire sous le capot chimique.</li>
	<li>Préparez le mélange maître contenant tous les composants du test sauf la cible. Calculez le volume de mixage maître (mélange V) en multipliant le volume d’échantillon (60 μL) par le nombre d’échantillons plus un (n+1) : 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq01.jpg" style="margin: auto;"> Le nombre d’échantillons n doit inclure les témoins négatifs et positifs nécessaires.</li>
	<li>Combinez 0,25x Vmix μL de 4x tampon de dosage, 0,1x Vmix μL de 0,1 mM AO, 0,1x Vmix μL de 10 μM SLAS-S et 0,1x Vmix μL de 10 μM SLAS-S. Ajouter de l’eau exempte de nucléases au volume final de <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq02.jpg" style="margin: auto;"> manière à ce qu’elle puisse accueillir le volume cible ajouté à l’étape 3.4. Vortex et centrifugez brièvement le mélange principal. Aliquote 50 μL du mélange maître dans n tubes d’échantillon. REMARQUE : Le volume de l’échantillon peut être ajusté en fonction des caractéristiques de l’instrument utilisé pour détecter le signal fluorescent. Le volume du mélange maître qui est aliquote dans les tubes d’échantillonnage peut être ajusté en fonction du volume cible ajouté à l’étape 3.4. Le volume d’eau sans nucléases ajouté pour faire le mélange maître doit être ajusté en conséquence. Par exemple, si l’échantillon contenant la cible est ajouté à 10 % (V/V) du volume final de l’échantillon, de l’eau doit être ajoutée au mélange maître jusqu’à 0,9 fois lemélange V.</li>
	<li>Utilisez un échantillon comme témoin sans cible (blanc) et un échantillon comme témoin positif. Ajoutez 10 μL de l’échantillon contenant la cible au mélange maître (50 μL) pour obtenir le volume final de l’échantillon de 60 μL contenant une cible de 10 à 1000 nM. Pour le blanc, utilisez de l’eau sans nucléase (10 μL) au lieu de la cible. Pour le contrôle positif, utilisez un oligonucléotide d’ADN synthétique contenant la séquence ciblée (p. ex., cible M, tableau 1). Ajouter 10 μL de témoin 0,6-3 μM pour obtenir une concentration finale de 0,1-0,5 μM. REMARQUE : La fluorescence élevée de ce contrôle positif garantit que le test fonctionne comme prévu, même si un signal négatif est observé pour les échantillons inconnus testés.</li>
	<li>Mélangez les échantillons et faites-les tourner à l’aide d’une microcentrifugeuse. Incuber les échantillons à 22 °C pendant 10 à 60 min. Le signal n’augmente que de &lt;15 % entre 40 min et 60 min (Figure 3).</li>
	<li>Mesurer la fluorescence des échantillons à 540 nm lors de l’excitation à 475 nm à l’aide d’un spectrophotomètre fluorescent. REMARQUE : Il est possible d’utiliser un fluorimètre portable qui mesure la fluorescence dans des tubes PCR à paroi mince. Le fluorimètre doit être équipé de filtres d’excitation et d’émission adaptés à la détection de la fluorescence AO. Un exemple de filtre d’excitation approprié est un filtre passe-bas de 495 nm. Un exemple de filtre antipollution approprié est 510-580 nm. Alternativement, le signal peut être observé visuellement lors de l’excitation de la fluorescence AO dans l’échantillon avec une source de lumière UV ou bleue. ATTENTION : Si une lampe UV est utilisée, portez des lunettes de protection UV.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig3.jpg"> 
Figure 3 : Dépendance temporelle de la génération du signal pour SLAS-29U/30S. Un échantillon contenant AO, SLAS-29U et SLAS-30S a été analysé à l’aide du mode cinétique d’un spectrophotomètre fluorescent (excitation à 475 nm, émission à 540 nm, fentes d’excitation/émission à 5 nm) pendant 60 min. À un moment de 5 minutes (indiqué par une flèche), la cible M a été ajoutée à l’échantillon. La moyenne des données provient de deux essais indépendants. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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<li>Vaidya, M., Bacchus, M., Sugaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+sequences+of+exosomal+NANOG+DNA+as+a+potential+diagnostic+cancer+marker%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential sequences of exosomal NANOG DNA as a potential diagnostic cancer marker.</a> PLoS One. 13, e0197782(2018).</li>
<li>Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Walder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+stability+of+DNA+duplexes+in+solutions+containing+magnesium+and+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations.</a> Biochemistry. 47, 5336-5353 (2008).</li>
<li>Bhattacharyya, D., Arachchilage, G. M., Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+cations+in+G-quadruplex+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal cations in G-quadruplex folding and stability.</a> Front Chem. 4, 2296-2646 (2016).</li>
<li>Chen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+of+free+and+protein-bound+auramine+O%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fluorescence of free and protein-bound auramine O.</a> Arch Biochem Biophys. 179 (2), 672-681 (1977).</li>
<li>Klymchenko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvatochromic+and+fluorogenic+dyes+as+environment-sensitive+probes%3A+Design+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Solvatochromic and fluorogenic dyes as environment-sensitive probes: Design and biological applications.</a> Acc Chem Res. 50 (2), 366-375 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Auramine O</td><td>MP Biomedicals&nbsp ;</td><td>195064</td><td>Colorant fluorogène utilisé pour la transmission de signaux</td></tr><tr><td>Fluorimètre Cary Eclipse</td><td>Agilent Technologies</td><td>G9800A</td><td>pour mesurer le signal fluorescent des échantillons</td></tr><tr><td>Dimethy Sulfoxyde</td><td>MP Biomedicals&nbsp ;</td><td>196055</td><td>solvant pour préparer des solutions mères d’Auramine O</td></tr><tr><td>Oligonucléotides d’ADN (amorces, brins SLAS, matrice synthétique pour PCR)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Fabriqué sur mesure et dessalé par le vendeur, utilisé sans autre purification</td></tr><tr><td>Mélange dNTP, 10 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Réf. R0191</td><td>pour la réaction PCR TARDIVE</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td>composant tampon ; nécessaire à l’association correcte des brins de la sonde avec la cible analysée</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation (1,5 ml)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Plastique pour la préparation des échantillons</td></tr><tr><td>Micropipette (0,1-2,5 & micro ; L)</td><td>Eppendorph</td><td>K56877G</td><td>utilisé pour la préparation des échantillons</td></tr><tr><td>Micropipette (100-1000 & micro ; L)</td><td>Eppendorph</td><td>K13160F</td><td>utilisé pour la préparation des échantillons</td></tr><tr><td>Micropipette (20-200 & micro ; L)</td><td>Eppendorph</td><td>J05253M</td><td>utilisé pour la préparation des échantillons</td></tr><tr><td>Micropipette (2-20 &micro ; L)</td><td>Eppendorph</td><td>G24675G</td><td>utilisé pour la préparation des échantillons</td></tr><tr><td>Mini centrifugeuse</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>6770</td><td>utilisé pour faire tourner les échantillons&nbsp ;</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases (non traitée au DEPC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Référence AM9932</td><td>Utilisation pour les échantillons dans les tests PCR et SLAS</td></tr><tr><td>Tubes PCR (0,5 ml)</td><td>Invitrogen</td><td>Référence AM9932</td><td>pour mesurer la fluorescence à l’aide du fluorimètre Quantus</td></tr><tr><td>pointes Pipett (20-200 & micro ; L)</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td>Plastique pour la préparation des échantillons</td></tr><tr><td>Pointes de pipette (1-10 uL)</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td>Plastique pour la préparation des échantillons</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>composant tampon ; nécessaire au pliage correct du domaine de l’aptamère lumineux fluorescent de la sonde</td></tr><tr><td>Fluorimètre Quantus</td><td>Promega</td><td>E6150</td><td>Fluorimètre portable à faible coût qui peut être utilisé pour les mesures de fluorescence</td></tr><tr><td>Cuvette en quartz</td><td>Starna</td><td>16.50F-Q-10/Z15</td><td>à utiliser pour la mesure de fluorescence à l’aide du fluorimètre Cary Eclipse</td></tr><tr><td>ADN polymérase Taq avec tampon Taq standard</td><td>BioLabs de la Nouvelle-Angleterre</td><td>M0273S</td><td>pour l’amplification d’un fragment de gène à analyser avec le test SLAS&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tampon Tris-HCl (pH 7,4)</td><td>Boston Bioproducts</td><td>Le R-314</td><td>composant tampon</td></tr><tr><td>Lampe UV</td><td>UVP</td><td>95-0016-14</td><td>pour exciter l’AO pour l’observation visuelle du signal</td></tr><tr><td>Mélangeur Vortex</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>utilisé pour le mixage des échantillons</td></tr></tbody></table>

sonde d’hybridation fendue utilisant un aptamère lumineux fluorescent d’adn comme rapporteur de signal pour l’analyse d’acides nucléiques spécifiques à une séquence

Split Hybridization Probe Utilizing a DNA Fluorescent Light-up Aptamer as a Signal Reporter for Sequence-Specific Nucleic Acid Analysis

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Démonstration de la quantification des ADN double brin à l'aide Molecular Probes PicoGreen colorant et spectrophotomètre Hitachi fluorescence F-7000 équipé d'un accessoire lecteur de microplaques.

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Dans cette vidéo, les cellules infectées par des virions MCPyV ont été soumises à une réaction en chaîne d’hybridation in situ pour détecter des génomes spécifiques de MCPyV. De plus, la technique DNA-HCR a été combinée à FISH pour visualiser l’ADN MCPyV dans les cellules de peau humaine infectées.

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Présenté ici est un protocole pour une approche d’imagerie par fluorescence, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA , and protein (MICDDRP), une méthode capable de visualiser simultanément par fluorescence unicellulaire de protéines virales et d’acides nucléiques de différents types et brins. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de systèmes.

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Nanomachines à base de DNAzyme 10-23 pour la reconnaissance des acides nucléiques

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Sonde d’hybridation fendue utilisant un aptamère lumineux fluorescent d’ADN comme rapporteur de signal pour l’analyse d’acides nucléiques spécifiques à une séquence (Vidéo) | JoVE Journal

Sonde d’hybridation fendue utilisant un aptamère lumineux fluorescent d’ADN comme rapporteur de signal pour l’analyse d’acides nucléiques spécifiques à une séquence

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