Sonde d’hybridation fendue utilisant un aptamère lumineux fluorescent d’ADN comme rapporteur de signal pour l’analyse d’acides nucléiques spécifiques à une séquence

Nous développons de nouveaux types de sondes d’hybridation fluorescente pour l’analyse des acides nucléiques spécifiques à une séquence. Plus récemment, les outils d’analyse d’hybridation se sont élargis avec des tests qui tirent parti des systèmes CRISPR-Cas. À l’heure actuelle, les sondes d’hybridation de pointe, telles que TaqMan, et les sondes de balise moléculaire, sont les plus utilisées pour analyser les cibles d’acide nucléique.

La détection précise des substitutions de nucléotides uniques et des cibles d’acides nucléiques est encore un défi pratique. Notre protocole garantit le niveau requis d’activité cellulaire tout en fournissant une lecture du signal fluorescent sans marquage. Pour commencer, concevez les séquences de deux brins d’oligonucléotides d’ADN non modifiés constituant les SLAS.

Utilisez un fragment contenant des nucléotides pour 6 à 39 de DAP-10-42. Convertissez la tige 1 composée des nucléotides 1 à 8 et 36 à 42 en tige 1 prime en retirant une thymine bombée en position 5, en raccourcissant la tige en quatre paires de bases et en ajoutant une paire de bases cytosine-guanine terminale. Incluez les nucléotides 9 à 29 dans un brin SLAS et les nucléotides 30 à 35 dans l’autre.

Étendez la séquence terminale des trois premiers du fragment avec les nucléotides 9 à 29 en ajoutant du désoxy GGTCAT. Étendez ensuite la séquence terminale à cinq premiers du fragment 30 à 35 avec le TGACC désoxy pour former une paire de six bases stem 2. Étendez maintenant la tige 1 prime sur les deux brins avec des liaisons désoxy TT et des séquences d’ADN complémentaires à la cible de l’acide nucléique.

Cela donne les séquences de brins SLAS-U et SLAS-S constituant la sonde. Faites en sorte que SLAS-S soit complémentaire à une région de 7 à 10 nucléotides. Cela inclut le site de substitution d’un seul nucléotide.

Assurez-vous ensuite que le bras de liaison cible de SLAS-U est complémentaire à un fragment de nucléotide de 15 à 25 adjacent à la région SLAS-S. Évaluez les températures de fusion des duplex de liaison cibles à l’aide du serveur Web UNAFold. Cliquez sur l’onglet INAMelt.

Allez dans Applications et sélectionnez Hybridation par fusion à deux états. Entrez les séquences en interaction dans l’ordre cinq premiers à trois premiers dans les cases de gauche et de droite. Ajustez ensuite la température d’essai à 22 degrés Celsius et entrez les concentrations de cations monovalents et divalents à 20 millimolaires et 25 millimolaires, respectivement.

Ajustez les concentrations des séquences en interaction dans la case correspondante. Appuyez sur Soumettre et examinez les valeurs de variation d’énergie de Gibbs, d’enthalpY, d’entropie et de température de fusion pour les duplex correspondants. Vérifiez que les températures de fusion des cibles parfaitement appariées et les bras de liaison des cibles de SLAS-S et SLAS-U sont supérieures à la température de test, soit 22 degrés Celsius.

Assurez-vous que le duplex entre SLAS-S et une cible non adaptée produit des températures de fusion inférieures à la température de test pour maintenir la spécificité. Si nécessaire, ajustez la longueur des bras de liaison de la cible pour répondre à ces conditions. Obtenez les brins d’oligonucléotides SLAS-U et SLAS-S finalisés auprès d’un fournisseur d’ADN commercial ou synthétisez-les en interne à l’aide d’un synthétiseur d’ADN automatisé.

Préparer les solutions mères d’Auramine O, SLAS-S, SLAS-U et le tampon de dosage. Préparez le mélange maître contenant tous les composants du test sauf la cible. Ajoutez de l’eau sans nucléases aux cinq derniers volumes du mélange principal.

Ensuite, vortex et faites tourner le mélange principal. Distribuez 50 microlitres dans chaque tube d’échantillon. Ensuite, étiquetez un échantillon comme un échantillon sans cible vide et un autre comme témoin positif.

Ajoutez 10 microlitres d’échantillon contenant la cible dans un tube contenant le mélange principal pour obtenir un échantillon de 60 microlitres. Pour le blanc, ajoutez 10 microlitres d’eau sans nucléases. Ensuite, pipetez 10 microlitres d’oligonucléotide d’ADN synthétique contenant la séquence cible dans le tube de contrôle positif.

Mélangez brièvement tous les échantillons dans la centrifugeuse à l’aide d’une microcentrifugeuse. Ensuite, incubez les tubes à 22 degrés Celsius pendant 10 à 60 minutes. Mesurez la fluorescence à 540 nanomètres lors de l’excitation à 475 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre fluorescent.

SLAS a été conçu pour cibler un fragment spécifique du gène NANOGP8. La cible M était entièrement complémentaire au brin SLAS-S, tandis que la cible MM avait une position de nucléotide cytosine de 1, 423, introduisant une discordance avec SLAS-S. Lors de l’ajout de la cible M entièrement complémentaire, la fluorescence a augmenté régulièrement et s’est stabilisée après 45 à 50 minutes.

Cependant, un signal clair était détectable en 10 minutes avec un rapport signal/blanc de 10. La sortie de fluorescence a augmenté linéairement avec une concentration cible allant jusqu’à 500 nanomolaires, ce qui a permis la quantification et la détermination des limites de détection. Les échantillons amplifiés par PCR ont montré des niveaux de signal variables, seul l’échantillon 2 dépassant la valeur seuil de fluorescence de 2.

Sur la base de la courbe d’étalonnage, la concentration de NANOGP8 amplicon dans l’échantillon 2 a été estimée à 124+ ou 13 nanomolaires. La détection par fluorescence du signal SLAS était cohérente à la fois sur un spectrophotomètre de paillasse et sur un fluorimètre portable. Un rapport signal/blanc supérieur à 20 a également été observé visuellement à l’aide de la lumière UV.