Un cadre d’imagerie multimodale pour faire progresser le phénotypage de cellules cancéreuses du sein vivantes sans marquage

Dans le cadre de notre protocole, nous présentons l’imagerie multimodale à l’aide de la microspectroscopie Raman confocale et de la microscopie de phase tomographique pour un phénotypage morphochimique rapide et non biaisé des cellules cancéreuses du sein humain dans leur environnement physiologique natif. La combinaison de la microspectroscopie Raman et de la microscopie de phase par tomographie permet une imagerie sans marquage dans des conditions physiologiques, fournissant des informations biochimiques et morphologiques sur les cellules et répondant aux limites des méthodes perturbatives conventionnelles, telles que le marquage par fluorescence ou la fixation chimique. Nos résultats démontrent un fort potentiel de mise en œuvre d’une approche multimodale dans la fourniture de phénotypage morphochimique des cellules cancéreuses du sein. De plus, sa polyvalence, sa reproductibilité et son caractère non invasif en ont fait un outil prometteur pour un large éventail d’applications biomédicales, des études fondamentales de biologie cellulaire au diagnostic.

Notre objectif est de créer un atlas de biomarqueurs optiques pour le contrôle de la qualité embryonnaire non invasif, la détection de la sénescence cellulaire et le criblage de médicaments dans des modèles organoïdes afin de faire progresser la médecine régénérative et la recherche sur les maladies.

[Instructeur] Pour commencer, placez l’échantillon de cellules cancéreuses du sein humain MDA-MB-231 dans l’incubateur sur scène. Ajoutez de l’eau pour l’objectif d’immersion dans l’eau. Allumez l’alimentateur automatique à immersion dans l’eau pour fournir de l’eau à la lentille de l’objectif. Vérifiez régulièrement les niveaux d’eau pour éviter l’évaporation et assurer des conditions d’imagerie constantes tout au long des mesures. Maintenant, allumez le laser de la pompe et ajustez sa sortie pour atteindre une puissance laser de 75 milliwatts au niveau du plan d’échantillonnage. Ouvrez le logiciel de contrôle de microscope Micro-Manager. Dans les paramètres de configuration, sélectionnez BF et cliquez sur en direct sur le côté gauche de la fenêtre du logiciel. Choisissez la cellule individuelle souhaitée, puis cliquez sur Arrêter pour mettre fin à la visualisation en fond clair. Ouvrez le logiciel de contrôle de la caméra CCD. Dans le cadre de l’expérience, réglez le temps d’exposition sur 1,5 seconde. Cliquez sur Exécuter dans la barre d’outils de l’expérience et activez le faisceau laser. Ensuite, ajustez la position Z pour maximiser le nombre de signaux dans la région des empreintes digitales de 600 à 1 800 centimètres inverses, puis éteignez le laser. Cliquez sur Arrêter dans la barre d’outils de l’expérience et quittez le logiciel. Démarrez le processus d’acquisition de données à l’aide du script MATLAB, qui gère automatiquement les canaux Raman dans les mesures multidimensionnelles et enregistre les données. Réglez le champ de vision sur un carré de 50 x 50 micromètres avec une résolution de 40 x 40 pixels, chaque pixel couvrant un carré de 1,25 x 1,25 micromètre. Réglez le temps d’exposition de chaque spectre Raman sur 1,5 seconde et exécutez le script MATLAB. Pour le post-traitement des cartes hyperspectrales Raman, lancez l’outil Web RamApp. Importez les données hyperspectrales en cliquant sur nouveau dans l’onglet mes analyses et téléchargez le fichier .mat contenant les variables de données spatiales et spectrales, ainsi que la variable de l’axe X. Pour tronquer le spectre, dans le menu Recadrage et rotation, choisissez Recadrage spectral. Définissez les limites inférieure et supérieure de la région de décalage Raman comme étant respectivement de 600 et 1 800 centimètres inverses. Pour corriger les rayons cosmiques, allez dans débruitage, cliquez sur despike, sélectionnez Z-score comme méthode et réglez le seuil sur huit. Cochez les options Utiliser la première différence et Corriger les pointes, puis cliquez sur Exécuter pour appliquer la correction. Pour supprimer le bruit des cartes, cliquez sur Lisser la carte, choisissez le filtre médian, définissez la taille du carré sur trois pixels, puis cliquez sur Exécuter. Pour lisser le spectre de chaque pixel, choisissez le filtre Savistky-Golay. Définissez la longueur de la fenêtre de filtre sur sept et l’ordre polynomial sur deux, puis cliquez sur Exécuter. Pour soustraire le signal de fond moyen, ouvrez le retrait optique du substrat et cliquez sur identifier le substrat. Définissez les k-moyennes comme méthode avec deux clusters. Cliquez ensuite sur Options avancées. Choisissez le nettoyage morphologique pour supprimer les petites taches du premier plan, puis cliquez sur Exécuter. Pour supprimer le signal de fond moyen, cliquez sur supprimer le substrat, puis choisissez la moyenne globale ou la moyenne de la méthode centrale des 95 % des valeurs et cliquez sur exécuter. Pour corriger la fluorescence de la ligne de base, ouvrez le panneau de la ligne de base, cliquez sur la ligne de base correcte, sélectionnez la lissage adaptative PLS, puis réglez lambda sur 5 millions et cliquez sur exécuter. Pour la normalisation de chaque carte hyperspectrale Raman, accédez à Divers, sélectionnez normaliser, choisissez la méthode Frobenius et cliquez sur Exécuter. Pour générer une image en fausses couleurs montrant une distribution subcellulaire, dans le panneau des images, cliquez sur le symbole du menu d’ouverture sous l’image d’intensité, puis cliquez sur Modifier l’image. Dans le panneau d’édition, sélectionnez une seule bande et définissez la plage spectrale. Maintenant, choisissez la couleur double sur la palette de couleurs, puis définissez la couleur, le seuil d’intensité et l’opacité avant de cliquer sur confirmer. Pour télécharger un spectre ponctuel unique, choisissez un pixel d’intérêt, puis dans le panneau de légende spectrale, cliquez sur télécharger le spectre. Enfin, pour exporter les spectres de premier plan et de substrat, accédez à la légende spectrale, puis cliquez sur télécharger le spectre pour les sections de premier plan et de substrat. Placez une goutte d’eau distillée sur la lentille de l’objectif du microscope. Positionnez l’échantillon sur la platine de translation du microscope, puis ajustez la position de l’échantillon pour l’aligner avec la lentille de l’objectif. Allumez le microscope et lancez le logiciel d’imagerie. Cliquez sur l’icône du microscope dans la barre d’outils. Après l’initialisation, cliquez sur configuration, sélectionnez la cellule active dans le panneau de travail et PBS comme support. Ensuite, accédez à l’onglet d’étalonnage dans le panneau de configuration du logiciel d’imagerie. Réglez les positions axiales de l’objectif et du condenseur en sélectionnant respectivement la mise au point et la surface. Maintenant, cliquez sur le mode de balayage pour ajuster manuellement les objectifs et vous assurer que les motifs d’éclairage sont centrés et presque statiques. Choisissez le mode normal, puis ajustez l’étape de traduction pour amener la cellule dans le champ de vision et faire la mise au point sur l’échantillon. Ajustez l’étape de traduction pour localiser une région sans cellules. Choisissez de calibrer pour capturer plusieurs hologrammes 2D à différents angles d’éclairage. Ajustez l’étape de traduction pour centrer la cellule, puis accédez à l’onglet Acquisition et sélectionnez Instantané 3D pour capturer le tomogramme de la cellule. Pour visualiser les tomogrammes holographiques, sélectionnez les données dans le panneau de navigation des données, cliquez avec le bouton droit de la souris, puis cliquez sur Ouvrir. Dans le panneau du gestionnaire de données, cliquez sur tomogramme RI. Dans le panneau de visualisation du volume, sélectionnez RI et dessinez quatre zones de couleur rectangulaires dans le canevas RI. Définissez les valeurs minimale et maximale de la plage d’instances réservées pour chaque zone de couleur, puis associez une opacité et une couleur à chaque zone. Cliquez sur Enregistrer pour stocker les plages d’instances réservées et les zones de couleur définies. Pour obtenir des descripteurs quantitatifs de la morphologie cellulaire, utilisez l’interface d’analyse. Sélectionnez manuel dans le panneau de segmentation, puis définissez 1,3450 comme seuil d’IR et cliquez sur Appliquer. Cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les indices morphologiques calculés. La cartographie spectrale Raman a révélé la distribution spatiale du cytoplasme, du noyau, de la phénylalanine et des lipides au sein des cellules MDA-MB-231 individuelles. Des pics spectraux Raman distincts correspondant au cytoplasme, au noyau, à la phénylalanine et aux lipides ont été confirmés dans la région de l’empreinte digitale entre 600 et 1 800 centimètres inverses. Les cartes thermiques de l’indice de réfraction des cellules uniques ont révélé la distribution interne des composants subcellulaires dans le plan axial XY, le plan sagittal YZ et les plans coronaux XZ. Une reconstruction tomographique 3D a permis d’identifier des régions d’indice de réfraction volumétrique correspondant à des sous-structures internes. Les mesures morphologiques quantitatives d’une seule cellule MDA-MB-231 ont montré différents descripteurs de la morphologie cellulaire, avec un volume total de 4024,189 micromètres cubes et une surface de 2383,707 micromètres carrés, avec un indice de réfraction moyen de 1,356.