Génération de génomes bactériens entiers à partir d’échantillons cliniques à l’aide d’un flux de travail d’enrichissement cible

Les génomes peuvent fournir des informations sur l’ascendance, la transmission et les capacités d’un agent pathogène. Pour les bactéries non cultivables, cette information ne peut être obtenue que par l’enrichissement ciblé. Le séquençage des agents pathogènes bactériens directement à partir d’échantillons cliniques est difficile en raison de l’ADN humain écrasant, de la diversité du microbiote et des charges bactériennes extrêmement faibles.

Dans de nombreux cas, la culture n’est pas une option, en raison de la méthode d’échantillonnage et des bactéries fastidieuses. En appliquant cette technologie aux bactéries sexuellement transmissibles, nous avons découvert une nouvelle lignée LGV de Chlamydia trachomatis appelée génotype L4 ompA, et confirmé l’expansion mondiale de la lignée LGV dominante, fournissant des informations clés pour le diagnostic moléculaire et la surveillance épidémiologique. Ce protocole d’enrichissement progressif permet une récupération complète du génome à partir d’échantillons cliniques d’IST diagnostiqués positifs.

Nous avons constaté que cette technique surpasse le séquençage profond métagénomique, l’appauvrissement de l’ADN de l’hôte et le séquençage adaptatif des nanopores. Nous étudions les souches en circulation de ces agents pathogènes en Europe et en Argentine. Cela a le potentiel d’éclairer sur la transmission et la gestion des antimicrobiens.

Pour commencer, mesurez la concentration d’ADN des extraits d’ADN à partir d’échantillons cliniques à l’aide d’une méthode sensible et précise basée sur la fluorescence. Diluez chaque échantillon d’ADN à l’aide d’eau sans nucléase à 10 à 200 nanogrammes dans un volume final de 17 microlitres dans chaque bandelette de tube PCR. Ajoutez 3 microlitres de mélange maître de fragmentation dans chaque puits contenant les 17 microlitres d’ADN dilué.

Pipetez de haut en bas 20 fois pour bien mélanger. Ensuite, scellez la bande de tube PCR. Vortex la bande à grande vitesse pendant 10 secondes et tournez-la brièvement pour recueillir le contenu.

Ensuite, placez la bande de tube PCR dans le thermocycleur et démarrez le protocole préprogrammé de fragmentation et d’incubation. Ensuite, préparez le master mix de réparation d’extrémité et de dA-tailing comme indiqué dans le tableau. Vortex et faites tourner le tube comme indiqué précédemment et maintenez-le sur la glace.

Ensuite, pipetez 20 microlitres de réparation d’extrémité et de mélange maître dA-tailing dans chaque puits contenant 50 microlitres de fragments d’ADN. Scellez la bande et le vortex à grande vitesse pendant huit secondes. Après avoir brièvement essoré la bande, remettez-la dans le thermocycleur.

Une fois le programme du thermocycleur terminé, placez la bande de tube PCR sur de la glace. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de mélange maître de ligature à température ambiante, qui a été préparé 30 à 45 minutes à l’avance dans chaque puits contenant les fragments d’ADN. Ajoutez 5 microlitres d’oligo mix d’adaptateur pour les bibliothèques étiquetées NBC dans chaque puits.

Remettez immédiatement la bande de tube PCR dans le thermocycleur et poursuivez le programme. Pour commencer la purification de l’ADN, récupérez les billes magnétiques à 4 degrés Celsius et laissez-les revenir à température ambiante avant de les utiliser. Ensuite, ajoutez 80 microlitres dans chaque puits d’échantillon.

Placez la bande de tube PCR sur le support magnétique et lavez chaque puits deux fois avec 200 microlitres d’éthanol à 70 %. Attendez une minute lors de chaque lavage et retirez soigneusement l’éthanol sans déranger les billes magnétiques. Après avoir mélangé et incubé les billes avec 35 microlitres d’eau sans nucléases pendant cinq minutes, aspirez soigneusement le surnageant éliminé de chaque puits et transférez-le dans un puits correspondant dans une nouvelle bande de tube PCR.

Placez la nouvelle bande de tube PCR sur de la glace et jetez les billes magnétiques. Prenez le mélange de réaction PCR préparé avant la recapture et ajoutez-en 11 microlitres dans chaque puits d’échantillon contenant la banque d’ADN purifié. Ajoutez 5 microlitres de l’indice de réparation primaire sélectionné à chaque réaction et scellez la bandelette de tube PCR.

Démarrez le programme du thermocycleur pour l’amplification PCR comme spécifié dans le tableau pour effectuer la PCR de pré-capture. N’ajoutez la bande de tube PCR qu’une fois que le thermocycleur a atteint 98 degrés Celsius. Une fois la PCR de pré-capture terminée, effectuez un autre nettoyage à base de billes pour purifier la bibliothèque.

Incuber le produit PCR avec des billes magnétiques. Ensuite, placez le tube de bandelette PCR sur un dispositif de séparation magnétique et attendez 5 à 10 minutes jusqu’à ce que la solution devienne claire. Pendant que la bande reste sur le support magnétique, retirez et jetez soigneusement le surnageant transparent de chaque puits.

Ensuite, éluez l’ADN dans 15 microlitres d’eau sans nucléase et mesurez la concentration d’ADN de la bibliothèque d’ADN purifiée. Pour l’hybridation d’échantillons, programmez le thermocycleur selon le protocole spécifié ici. Démarrez le programme et mettez immédiatement l’exécution en pause.

Diluez 500 à 1 000 nanogrammes des banques d’ADN préparées dans un volume final de 12 microlitres en utilisant de l’eau sans nucléases. Après avoir tourbillonné et fait tourner le mélange de bloqueurs d’oligonucléotides, ajoutez 5 microlitres dans chaque tube d’échantillon. Scellez la bande de tube PCR et placez-la dans le thermocycleur.

Mettez le thermocycleur en pause lorsqu’il atteint la troisième étape du protocole. Ajoutez 13 microlitres du mélange d’hybridation de sonde à température ambiante préparé à chaque échantillon tout en gardant la bande à l’intérieur du thermocycleur. Pipeter lentement de haut en bas 8 à 10 fois pour mélanger.

Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air et remettez la bande dans le thermocycleur. Ensuite, vérifiez que tous les tubes sont hermétiquement scellés. Pour capturer la bibliothèque hybride, transférez le volume entier de chaque tube dans les tubes correspondants contenant 200 microlitres de billes de streptavidine prélavées.

Récupérez les billes de streptavidine avant de les laver avec un tampon de lavage à température ambiante. Une fois la bande de tube PCR retirée du séparateur magnétique, ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage à haute température préchauffé à 70 degrés Celsius et remettez les billes en suspension en pipetant de haut en bas. Scellez la bande tubulaire, vortex à grande vitesse et tournez rapidement comme démontré précédemment.

Placez la bande tubulaire scellée dans le bloc du thermocycleur à 70 degrés Celsius et incubez pendant 5 minutes. Transférez la bande de tube PCR du thermocycleur vers le séparateur magnétique à température ambiante. Attendez une minute jusqu’à ce que la solution devienne claire.

Ensuite, retirez et jetez soigneusement le surnageant. Ensuite, ajoutez 25 microlitres d’eau sans nucléases dans chaque tube contenant les billes. Programmez le thermocycleur comme indiqué dans le tableau illustré ici.

Ajoutez 25 microlitres du mélange de réaction PCR post-capture préparé dans chaque tube d’échantillon. Mélangez la réaction jusqu’à ce que la suspension soit uniforme et scellez solidement la bande de tube PCR sans la faire tourner. Placez la bande de tube PCR scellée dans le thermocycleur.

Après avoir transféré le produit PCR dans un tube frais, ajoutez 50 microlitres de suspension de billes dans chaque tube d’échantillon et effectuez le nettoyage de l’ADN comme indiqué précédemment. Mesurez la concentration d’ADN de la banque d’ADN purifiée finale à l’aide d’une méthode de quantification basée sur la fluorescence. L’enrichissement de la cible a entraîné des pourcentages significativement plus élevés de lectures sur la cible, et donc des génomes complets par rapport au séquençage direct pour tous les agents pathogènes testés, y compris Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum et Mycoplasma Genitalium.

Le succès du séquençage du génome a été principalement observé dans des échantillons dont les valeurs seuils du cycle qPCR étaient inférieures à 30 pour les quatre agents pathogènes. Avec une corrélation inverse claire entre les valeurs CT et le pourcentage de lectures sur cible pour Chlamydia trachomatis. L’utilisation d’une température d’hybridation de 62,5 degrés Celsius par rapport aux 65 degrés Celsius précédents a amélioré la couverture génomique de Mycoplasma genitalium sans réduire le rendement des autres agents pathogènes cibles.

L’analyse phylogénétique des génomes de Chlamydia trachomatis d’Argentine a montré que de nombreux échantillons se regroupent au sein du clade L2b et a révélé une nouvelle lignée proposée comme génotype L4 ompA, séparée de tous les génomes LGV précédents par environ 600 polymorphismes nucléotidiques uniques.