Name: Génération de génomes bactériens entiers à partir d’échantillons cliniques à l’aide d’un flux de travail d’enrichissement cible (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Découvrez le séquençage de génomes bactériens entiers à partir d'échantillons cliniques par enrichissement ciblé. Cette méthode surpasse le séquençage métagénomique et permet la surveillance épidémiologique des infections sexuellement transmissibles.

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<ol><li>Lefterova, M. I., Suarez, C. J., Banaei, N., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+for+infectious+disease+diagnosis+and+management%3A+a+report+of+the+Association+for+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing for infectious disease diagnosis and management: a report of the Association for Molecular Pathology.</a> J Mol Diagn. 17 (6), 623-634 (2015).</li>
<li>Gwinn, M., Maccannell, D., Armstrong, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+of+infectious+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing of infectious pathogens.</a> JAMA. 321 (9), 893-894 (2019).</li>
<li>Hasman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+whole-genome+sequencing+for+detection+and+characterization+of+microorganisms+directly+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid whole-genome sequencing for detection and characterization of microorganisms directly from clinical samples.</a> J Clin Microbiol. 52 (1), 139-146 (2014).</li>
<li>Gautam, S., KC, R., Leong, K. W. C., Mac Aogáin, M., O'Toole, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step-by-step+beginner%27s+protocol+for+whole+genome+sequencing+of+human+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Methods%22%5BJournal%5D)">A step-by-step beginner's protocol for whole genome sequencing of human bacterial pathogens.</a> J Biol Methods. 6 (1), e110(2019).</li>
<li>Baert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+document+on+the+use+of+whole+genome+sequencing+%28WGS%29+for+source+tracking+from+a+food+industry+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Guidance document on the use of whole genome sequencing (WGS) for source tracking from a food industry perspective.</a> Food Control. 130, 108148(2021).</li>
<li>Didelot, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+clinical+microbiology+with+bacterial+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Genet. 13 (9), 601-612 (2012).</li>
<li>Scidmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+laboratory+maintenance+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and laboratory maintenance of Chlamydia trachomatis.</a> Curr Protoc Microbiol. 11, (2006).</li>
<li>Edmondson, D. G., Norris, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+the+syphilis+spirochete+Treponema+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of the syphilis spirochete Treponema pallidum.</a> Curr Protoc. 1 (2), e44(2021).</li>
<li>Pitt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+in+vitro+propagation+and+antimicrobial+susceptibility+testing+of+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Challenges of in vitro propagation and antimicrobial susceptibility testing of Mycoplasma genitalium.</a> J Antimicrob Chemother. 77 (11), 2901-2907 (2022).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+methods+for+genome+sequencing+of+Chlamydia+trachomatis+and+other+sexually+transmitted+bacteria+directly+from+clinical+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Evaluating methods for genome sequencing of Chlamydia trachomatis and other sexually transmitted bacteria directly from clinical swabs.</a> Microb Genom. 11 (2), 001353(2025).</li>
<li>Seth-Smith, H. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Res. 23 (5), 855-866 (2013).</li>
<li>SureSelect XT HS2 DNA kits: library preparation (+/-MBC) / fast-Hyb target enrichment / post-capture pooling workflow for Illumina platform NGS. , Agilent Technologies. 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G9983-90000.pdf</a> (2023).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+genomes+from+rectal+samples%3A+description+of+a+new+clade+comprising+ompA-genotype+L4+from+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Genom%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis genomes from rectal samples: description of a new clade comprising ompA-genotype L4 from Argentina.</a> Microb Genom. 11 (2), 001350(2025).</li>
<li>Brown, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+whole-genome+sequencing+by+SureSelect+target+enrichment%3A+a+robust+and+sensitive+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Norovirus whole-genome sequencing by SureSelect target enrichment: a robust and sensitive method.</a> J Clin Microbiol. 54 (10), 2530-2537 (2016).</li>
<li>Dao, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+SureSelect+target+enrichment+system+for+next-generation+sequencing+to+obtain+the+complete+genome+sequence+of+bovine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of the SureSelect target enrichment system for next-generation sequencing to obtain the complete genome sequence of bovine leukemia virus.</a> Arch Virol. 163 (11), 3155-3159 (2018).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SureSelect+targeted+enrichment%2C+a+new+cost+effective+method+for+the+whole+genome+sequencing+of+Candidatus+Liberibacterasiaticus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">SureSelect targeted enrichment, a new cost effective method for the whole genome sequencing of Candidatus Liberibacterasiaticus.</a> Sci Rep. 9 (1), 1-8 (2019).</li>
<li>Büttner, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ompA+sequencing+and+multilocus+sequence+typing+of+lymphogranuloma+venereum+cases+in+Buenos+Aires+reveal+new+Chlamydia+trachomatis+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">ompA sequencing and multilocus sequence typing of lymphogranuloma venereum cases in Buenos Aires reveal new Chlamydia trachomatis genotypes.</a> Microorganisms. 12 (3), 587(2024).</li>
<li>La Rosa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+anorectal+infections+by+LGV+%28L1%2C+L2+and+L2b%29+and+non-LGV+serotypes+in+symptomatic+patients+in+Buenos+Aires+Argentina%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis anorectal infections by LGV (L1, L2 and L2b) and non-LGV serotypes in symptomatic patients in Buenos Aires Argentina.</a> Int J STD AIDS. 32 (14), 1270-1278 (2021).</li>
<li>Rodríguez Fermepin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+L2b+in+rectal+lymphogranuloma+venereum%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Microbe%22%5BJournal%5D)">More than L2b in rectal lymphogranuloma venereum.</a> Lancet Microbe. 2 (2), e55(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Pipette 8 canaux 0,5-10 & micro ; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000010</td><td>Eppendorf Research&nbsp ; Plus, 8 canaux, 0,5-10 et micro ; L, gris moyen, volume variable.</td></tr><tr><td>Pipette 8 canaux 10-100 & micro ; L</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td>Eppendorf Research&nbsp ; Plus, 8 canaux, 10-100 et micro ; L, jaune, volume variable.</td></tr><tr><td>Adaptateur Oligo Mix pour les bibliothèques étiquetées MBC</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Système automatisé d’extraction d’acides nucléiques à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN viral/pathogène</td><td>Qiagen</td><td>937036 (Kit) / 9001297 (Instrument)</td><td>Instrument QIAsymphony SP/AS utilisé avec le kit QIAamp DSP Virus/Pathogen pour l’extraction automatisée de l’ADN.</td></tr><tr><td>Tampon de liaison</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-9687</td><td>Fait partie du kit d’enrichissement de cible SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (post-PCR).</td></tr><tr><td>Kit d’extraction d’ADN et instrument automatisé</td><td>Société de recherche Zymo</td><td>D3024/D3025</td><td>Kit Quick-DNA Miniprep utilisé pour l’extraction totale de l’ADN à partir d’échantillons cliniques. Compatible avec les flux de travail manuels ou automatisés.</td></tr><tr><td>Réparation d’extrémité - Un mélange d’enzymes de résidus</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Tampon de résidus de réparation d’extrémité</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>20816.298</td><td>Éthanol absolu &ge ; 99,5 % Ph. Eur., USP</td></tr><tr><td>Fluorimètre avec dosage de l’ADNdb à haute sensibilité / Méthode basée sur la fluorescence pour quantifier l’ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>Q33238, Q33231</td><td>Fluorimètre Qubit 4 avec kit de dosage haute sensibilité (HS) 1X dsDNA.</td></tr><tr><td>Tampon de fragmentation</td><td>Agilent Technologies</td><td>5191-4080</td><td>Fait partie du kit de fragmentation enzymatique SureSelect avec le nom ''5X Fragmentation Buffer''.</td></tr><tr><td>Fragmentation Enzyme</td><td>Agilent Technologies</td><td>5191-4080</td><td>Fait partie du kit de fragmentation enzymatique SureSelect.</td></tr><tr><td>Tampon d’ADN polymérase haute fidélité</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (Pre PCR) avec le nom ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>Tampon d’ADN polymérase haute fidélité avec dNTP (5X)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-9687</td><td>Fait partie du kit d’enrichissement de cible SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) avec le nom ''Herculase II Buffer''.</td></tr><tr><td>Enzyme de fusion haute-fidélité pour l’amplification par PCR</td><td>Agilent Technologies</td><td>5191-5688</td><td>Fait partie du kit d’enrichissement de cible SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) avec le nom ''Herculase II''.</td></tr><tr><td>Tampon de lavage à haute température</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-9687</td><td>Fait partie du kit d’enrichissement cible SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) avec le nom ''Wash buffer 2''.</td></tr><tr><td>Tampon d’hybridation&nbsp ;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Amorces de séquençage indexées</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>Fait partie des paires d’amorces d’indice SureSelect XT HS2 1-96 pour ILM (pré PCR).</td></tr><tr><td>Test PCR multiplex en temps réel en interne</td><td>Tib Molbiol</td><td>N/A</td><td>Test développé et accrédité en interne basé sur les kits Lightmix pour la détection des IST</td></tr><tr><td>Tampon de ligature</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Perles magnétiques pour le nettoyage</td><td>Agilent Technologies</td><td>5191-5740</td><td>Perles SureSelect DNA AMPure XP.</td></tr><tr><td>Support magnétique</td><td>Matériel de laboratoire Permagen</td><td>MSRLV08</td><td>0.2mL PCR 8 Strip Séparateur Magnétique 5 &micro ; L ~ 0,2 ml de volume.</td></tr><tr><td>Séquençage de nouvelle génération (NGS) : système de séquençage à lecture courte à haut débit</td><td>Illumina, Inc.</td><td>N/A</td><td>Séquençage apparié de 150 pb (PE150) effectué sur les plates-formes Illumina NextSeq1000 et MiSeq.</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>BioConcept</td><td>3-07F04-H</td><td>Eau pour la biologie moléculaire, sans ADN/DNAse/RNase, stérile, sans inhibiteur de PCR.</td></tr><tr><td>Mélange de bloqueurs d’oligonucléotides&nbsp ;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Bande de tube PCR</td><td>avantor, livré par VWR&nbsp ; &nbsp ;</td><td>732-3608</td><td>Bandelettes de tubes PCR avec capuchons plats attachés.</td></tr><tr><td>Mélange d’apprêt post-capture</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-9687</td><td>Fait partie du kit d’enrichissement de cible SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (post-PCR).</td></tr><tr><td>Sonde d’ARN</td><td>Agilent Technologies</td><td>5191-6916&nbsp ;</td><td>Sonde SureSelect Custom Tier4 6Mb-11.9Mb, par exemple Design ID S3465164).</td></tr><tr><td>Bloqueur de RNase</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré-PCR).</td></tr><tr><td>Tampon de lavage à température ambiante</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-9687</td><td>Kit d’enrichissement cible SureSelect ILM Hyb Module Box 1 (Post PCR) avec le nom ''Wash buffer 1''.</td></tr><tr><td>Perles de streptavidine</td><td>Agilent Technologies</td><td>5191-5742</td><td>Perles de streptavidine SureSelect.</td></tr><tr><td>T4 ADN ligase</td><td>Agilent Technologies</td><td>5500-0147</td><td>Fait partie du kit de préparation de bibliothèque SureSelect XT HS2 pour ILM (pré PCR) .</td></tr><tr><td>Méthode d’enrichissement de la cible / méthode de capture d’ADN</td><td>Agilent Technologies</td><td>Référence G9983-90000</td><td>Kit d’ADN SureSelect XT HS2 avec préparation de bibliothèque, enrichissement rapide de la cible et flux de travail de regroupement post-capture. Version du protocole F0, mai 2023. Pour la plate-forme NGS d’Illumina</td></tr><tr><td>Sonde d’enrichissement de la cible pour C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum et M. genitalium</td><td>Agilent Technologies / Laboratoire d’Enrichissement en Microbiologie (IMM, UZH)</td><td>Design ID S3465164</td><td>Kit de sondes conçu sur mesure (~242 000 sondes) pour la capture multiplex de quatre agents pathogènes IST. Conception basée sur plusieurs génomes de référence.</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Thermofischer</td><td>4375305</td><td>Thermocycleur Veriti à 96 puits.</td></tr></tbody></table>

génération de génomes bactériens entiers à partir d’échantillons cliniques à l’aide d’un flux de travail d’enrichissement cible

Generating Whole Bacterial Genomes from Clinical Samples using a Target Enrichment Workflow

Une étude sur l’épidémie de LGV de C. trachomatis à Buenos Aires, en Argentine, a montré de nouvelles caractéristiques dans les échantillons, à savoir, 10 substitutions de nucléotides dans le gène ompA par rapport au génotype L1 ompA, et une séquence inhabituelle de typage MLST (Multi-Locus Sequence Typage) de type 2 17,18,19. Notre objectif était d’étudier les génomes de ces échantillons cliniques, en les plaçant dans le contexte de données mondiales. Pour y parvenir, nous avons comparé les performances d’une approche d’enrichissement cible avec le séquençage métagénomique direct pour le séquençage génomique du séquençage génomique des IST bactériennes à partir d’échantillons cliniques, dans le but de surmonter les défis posés par de faibles charges bactériennes et une abondance d’ADN humain et microbien.
L’ADN utilisé provenait soit d’échantillons d’écouvillonnage rectal prélevés entre 2017 et 2023 à Buenos Aires, en Argentine, placés dans un milieu 2-SP (milieu saccharose-phosphate) complété par 2 % de sérum de veau fœtal (SCF) et d’antibiotiques (gentamicine 25 μg/mL, vancomycine 0,5 mg/mL et amphotéricine B 2,5 μg/mL) et stocké à −80 °C, soit dans un ensemble urétral, anorectal, et des écouvillons pharyngés prélevés à l’Hôpital universitaire de Zurich (USZ) dans un tampon TAAN (Nucleic Acid Amplification Tests). L’ADN des échantillons de Buenos Aires a été extrait à l’aide d’un kit d’extraction manuelle à base de silice, tandis que l’ADN des échantillons de l’USZ a été extrait à l’aide d’un système automatisé à base de billes magnétiques.
Tous les échantillons cliniques inclus dans cette étude ont été confirmés positifs par un test PCR multiplex en temps réel développé en interne (voir la table des matériaux) avec des valeurs seuils de cycle (Ct) qPCR allant comme suit : C. trachomatis : 17-34, N. gonorrhoeae :  24-31, T. pallidum : 27-36 et M. genitalium :  30-37. La concentration d’ADN a été quantifiée à l’aide d’un test fluorométrique à haute sensibilité avant le séquençage afin de caractériser le matériau d’entrée des échantillons cliniques (voir le tableau des matériaux).
Pour comparer le séquençage métagénomique direct à l’enrichissement ciblé, nous avons utilisé 32 échantillons, dont 29 étaient positifs pour C. trachomatis, neuf pour N. gonorrhoeae, cinq pour T. pallidum et trois pour M. genitalium. Le séquençage métagénomique direct n’a pas abouti à des génomes complets et a en effet à peine atteint des données cibles supérieures à la ligne de base observées dans les échantillons négatifs. L’enrichissement de la cible avec hybridation à 65 °C a donné des résultats nettement meilleurs pour chaque agent pathogène, et des génomes positifs ont été obtenus dans de nombreux cas à partir de cette méthode (Figure 1). 
Afin d’évaluer la sélection optimale d’échantillons pour l’enrichissement de la cible, nous avons évalué la relation entre les valeurs diagnostiques de la qPCR Ct et l’efficacité de la récupération du génome, mesurée par le pourcentage de lectures sur la cible ( %OTR). Cette mesure reflète la proportion de lectures de séquençage qui correspondent au génome de l’organisme cible et est couramment utilisée pour évaluer les performances d’enrichissement. Une corrélation significative a été observée entre la charge pathogène et le succès du séquençage pour C. trachomatis, avec un seuil Ct pour le succès autour de Ct30. Bien que les données sur les autres agents pathogènes cibles soient limitées, une tendance similaire a été observée, où le succès du séquençage du génome s’est produit principalement dans des échantillons dont la charge pathogène était inférieure à Ct30 (figure 2).
Cette expérience avec une température d’hybridation de 65 °C a donné des taux de réussite du séquençage du génome avec un enrichissement cible de 75 % à 80 % pour C. trachomatis, N. gonorrhoeae et T. pallidum, sur la base d’échantillons avec des valeurs Ct inférieures à 30. Les trois échantillons positifs à M. genitalium avaient des valeurs Ct de 30 à 37 et ont atteint une couverture génomique et une profondeur de lecture moyennes plus faibles. Afin d’améliorer ces résultats, nous avons expérimenté la réduction de la température d’hybridation, ce qui améliore l’hybridation en raison de la faible teneur en %G+C dans le génome de M. genitalium . En utilisant des températures d’hybridation plus basses, telles que la température maintenant recommandée de 62,5 °C, nous pouvons améliorer la récupération des génomes de M. genitalium sans compromettre la récupération d’autres génomes (Figure 3). Ces résultats démontrent que l’enrichissement des cibles est une approche efficace pour obtenir des informations génomiques précieuses à partir d’échantillons cliniques et peut être adapté à un large éventail de génomes, également dans le cadre d’une conception basée sur un panel.
L’analyse phylogénétique des génomes de C. trachomatis enrichis avec succès a montré que la majorité des échantillons de Buenos Aires se regroupent dans le clade du génotype L2b de l’ompA, suggérant une lignée réussie avec une circulation mondiale. L’analyse a également révélé la présence d’une nouvelle lignée distincte en Argentine, à l’origine de la LGV. Les échantillons de ce clade diffèrent d’environ 600 SNP des autres lignées LGV, et cette lignée est proposée comme génotype ompA L4 (Figure 4). Le tableau supplémentaire 1, 2 et 4 fournit une description détaillée des échantillons utilisés.
Ces résultats soulignent la valeur de l’enrichissement des cibles dans l’étude de la diversité des agents pathogènes et démontrent un haut degré de succès du séquençage du génome à partir d’échantillons cliniques.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig1.jpg"> 
Figure 1 : Enrichissement des génomes par enrichissement cible par rapport au séquençage métagénomique direct. Le pourcentage de lectures sur la cible ( %OTR), défini comme le pourcentage de lectures de séquençage correspondant au génome de l’organisme cible, indique le degré d’enrichissement atteint avec l’enrichissement de la cible. La ligne représente la médiane de tous les points de données, et la case indique l’écart interquartile (IQR) de 50 %. Les couleurs des points de données correspondent à la source de l’échantillon : bleu pâle pour l’Argentine et rouge pour la Suisse. Le succès du séquençage du génome, défini comme une couverture &gt;95 % et une profondeur de lecture moyenne &gt;10, est représenté par de grands points, tandis que l’échec est indiqué par de petits points. Notez les différentes échelles sur l’axe des y. Abréviations : CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Cette figure a été modifiée au lieu de10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig2.jpg"> 
Figure 2 : Corrélation du %OTR de l’enrichissement de la cible avec les valeurs diagnostiques de qPCR Ct. Les couleurs des points de données représentent la source de l’échantillon : bleu pâle pour l’Argentine et rouge pour la Suisse. Le succès du séquençage du génome, défini comme une couverture de &gt;95 % et une profondeur de lecture moyenne de &gt;10, est indiqué par de grands points, tandis que l’échec est représenté par de petits points. Notez les différentes échelles sur l’axe des y. Abréviations : CT = C. trachomatis, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. Cette figure a été modifiée au lieu de10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig3.jpg"> 
Figure 3 : Effet de la température d’hybridation sur la récupération de génomes complets chez tous les pathogènes bactériens IST dans dix échantillons. L’ADN humain dans la gamme de ceux des échantillons cliniques a été enrichi avec des concentrations connues d’ADN bactérien cible séparément (unique) et également complètement pour représenter un échantillon avec plusieurs infections (regroupé). Deux expériences, chacune avec les cinq agents pathogènes/combinaisons, ont été réalisées : 0,01 % et 0,03 % pour représenter le pourcentage approximatif d’ADN de chaque micro-organisme par rapport à l’ADN total dans l’échantillon (l’ADN restant correspond à l’ADN humain). La récupération de M. genitalium est améliorée à des températures plus basses. C. trachomatis L’ADN a été enrichi à une faible concentration ; d’autres expériences montrent que les températures n’ont pas affecté la récupération des génomes de C. trachomatis (données non présentées). Abréviations : CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. gonorrhoeae, TP = T. pallidum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68506/68506fig4.jpg"> 
Figure 4 : Phylogénie ajustée à la recombinaison des souches LGV d’Argentine. L’analyse comprend tous les génomes LGV disponibles avec des données publiées. Les métadonnées affichées à droite de la phylogénie comprennent des échantillons de patients en double, l’analyse bayésienne de la structure de la population (BAPS ; cluster = clade, le cluster polyphylétique BAPS 6 représentant la diversité génétique de la population), la méthode de séquençage du génome (données de cette étude), le génotype ompA, le pays et l’année, comme indiqué dans la légende en haut à gauche. Les données manquantes sont indiquées en blanc. Les noms des génomes de cette étude sont surlignés en bleu clair pour l’Argentine et en bleu foncé pour la Finlande (non obtenus par enrichissement de la cible). Ces couleurs sont utilisées uniquement pour distinguer les génomes générés dans cette étude. Les valeurs d’amorçage de 1000 amorçages ultrarapides sont affichées en pourcentage sur les principales branches. Ce chiffre a été modifié au lieu de13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/68506fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Description des matériaux, des réactifs, des instruments et de l’équipement utilisés dans l’étude. Le tableau comprend des renseignements détaillés sur le nom commercial, le fabricant et le numéro de catalogue des composants utilisés pour l’extraction de l’ADN, la préparation de banques, l’enrichissement de cibles et le séquençage. Il comprend également des articles utilisés pour les tests qPCR internes et les procédures générales de biologie moléculaire. Des alternatives équivalentes peuvent être utilisées pour les articles marqués d’un astérisque (*). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68506/Supplementary_Table_1_RE.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Génération de génomes bactériens entiers à partir d’échantillons cliniques à l’aide d’un flux de travail d’enrichissement cible

Obtaining complete genomes of bacterial sexually transmitted infections (STIs) directly from clinical samples is challenging due to the presence of human ...

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Research

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Nous décrivons une méthode pour effectuer l'analyse génétique dans Chlamydia basé sur la mutagenèse chimique et le séquençage complet du génome. En outre, un système d'échange de l'ADN dans les cellules infectées est décrite qui peut être utilisé pour la cartographie génétique. Cette méthode peut être largement applicable à des systèmes microbiens manquant des systèmes de transformation et des outils de génétique moléculaire.

Approches avant génétiques dans<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

l’enrichissement de l’ADNg pour le séquençage NGS est un outil simple et puissant pour l’étude des mutations constitutionnelles. Dans cet article, nous présentons la procédure pour analyser simplement la séquence complète de 11 gènes impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN.

ADNg enrichissement par une technologie basée Transposase-NGS Analyse de la séquence plénier de BRCA1, BRCA2, et 9 gènes impliqués dans la réparation des dommages de l'ADN

Un système intégré pour le séquençage ciblé de nouvelle génération d’échantillons d’oncologie est décrit. Ce système multiplateforme est optimisé pour les biopsies tumorales de faible qualité et de faible quantité, s’adapte à de faibles entrées d’ADN, comprend des contrôles multivariants bien caractérisés et dispose d’un nouvel appelant de variant qui est informé par des mesures quantitatives de contrôle de la qualité pré-analytiques.

Intégration de Wet and Processes Banc sec Optimise ciblés Séquençage de nouvelle génération de faible qualité et à faible quantité biopsies de tumeurs

Nous décrivons une méthode efficace, robuste et rentable pour extraire l'acide nucléique à partir des prélèvements pour la caractérisation des communautés bactériennes en utilisant ARNr 16S séquençage de l'amplicon du gène. La méthode permet une approche de traitement commun pour les types d'échantillons multiples et peut accueillir un certain nombre de processus d'analyse en aval.

L&#39;extraction d&#39;acide nucléique et efficace de l&#39;ARNr 16S bactérien pour Séquençage génique communautaire Caractérisation

Nous présentons ici un protocole pour enquêter sur génome large méthylation de l'ADN dans les études de patients cliniques à grande échelle de dépistage en utilisant le séquençage de l'ADN méthyl-Binding Capture (MBDCap-seq ou MBD-seq) la technologie et de la bioinformatique ultérieures analyse pipeline.

Méthyl-liaison par capture d&#39;ADN de séquençage pour les tissus du patient

Ce protocole est de récupérer et de préparer des cellules-cibles rares à partir d’un mélange avec des cellules non cibles fond pour la caractérisation génétique moléculaire au niveau unicellulaire. Qualité de l’ADN est égale à cellules individuelles non traitées et permet application unicellulaires (les deux dépistage basé et ciblée d’analyse).

Cible cellulaire pré-enrichissement et Whole Genome Amplification pour la cellule unique caractérisation en aval

Ce manuscrit décrit un protocole normalisé détaillé du séquençage de haut débit 16 s rRNA-amplicon. Le protocole introduit un protocole intégré, en uniforme, possible et peu coûteux à partir de prélèvement d’échantillons fécaux au moyen d’analyses de données. Ce protocole permet l’analyse d’un grand nombre d’échantillons contenant des normes rigoureuses et plusieurs contrôles.

Protocole de guidée pour la caractérisation microbienne fécale par 16 s rRNA-Amplicon séquençage

Ce protocole détaille une approche globale pour la culture, le séquençage et l’assemblage hybride de novo du génome des bactéries urinaires. Il fournit une procédure reproductible pour la génération de séquences génomiques complètes et circulaires utiles pour étudier les éléments génétiques chromosomiques et extrachromosomiques contribuant à la colonisation urinaire, à la pathogenèse et à la dissémination de la résistance aux antimicrobiens.

Assemblage hybride du génome de novo pour la génération de génomes complets de bactéries urinaires à l’aide de technologies de séquençage à lecture courte et longue

La faisabilité de stratégies de séquençage du génome entier (SGE) à l’aide d’instruments de paillasse a simplifié l’interrogation du génome de chaque microbe pertinent pour la santé publique en laboratoire. Une adaptation méthodologique du flux de travail pour le séquençage bactérien est décrite et un pipeline bioinformatique pour l’analyse est également présenté.

Caractérisation d’une souche pathogène d’Escherichia coli dérivée d’Oreochromis spp. Fermes utilisant le séquençage du génome entier

La métaprotéomique clinique offre un aperçu du microbiome humain et de ses contributions à la maladie. Nous avons exploité la puissance de calcul de la plateforme Galaxy pour développer un flux de travail bioinformatique modulaire qui facilite l’analyse métaprotéomique complexe basée sur la spectrométrie de masse et la caractérisation de divers types d’échantillons cliniques pertinents pour les études de maladies.

Un flux de travail de métaprotéomique clinique mis en œuvre au sein de la plateforme bioinformatique Galaxy pour analyser les interactions hôte-microbiome sous-jacentes aux maladies humaines

L’étude actuelle décrit un flux de travail pour le séquençage nanopore des plasmides lorsque la séquence chromosomique est déjà connue ou sans intérêt. Une étape initiale d’enrichissement de l’ADN plasmidique assure une profondeur optimale de séquence plasmidique et maximise le nombre d’échantillons pouvant être séquencés par cellule de flux.

Séquençage et assemblage de plasmides à longue lecture utilisant des flux de travail basés sur le séquençage nanopore

Découvrez le séquençage de génomes bactériens entiers à partir d'échantillons cliniques par enrichissement ciblé. Cette méthode surpasse le séquençage métagénomique et permet la surveillance épidémiologique des infections sexuellement transmissibles.

Génération de génomes bactériens entiers à partir d’échantillons cliniques à l’aide d’un flux de travail d’enrichissement cible

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