Un microscope Raman multimodal à grande transformée de Fourier
December 30th, 2025
Un microscope à transformée de Fourier à large champ, basé sur un interféromètre biréfringent compact et ultra-stable, permet l’acquisition parallèle des spectres pour tous les pixels d’un détecteur 2D. L’approche dans le domaine temporel permet de démêler la photoluminescence et les signaux Raman, et permet un cartographie Raman rapide (~5 ms/pixel) avec une résolution spatiale de ~1 μm et une résolution spectrale de 23 cm-1 .
Nous avons développé un microscope hyperspectral multimodal pour acquérir le spectre Raman ou photoluminescence de chaque pixel d’une image, ce qui réduit le temps de mesure. L’approche conventionnelle de mise à l’échelle raster repose sur des spectromètres dispersifs. Des techniques avancées améliorent le signal Raman soit par la lumière en résonance, soit par des impulsions laser courtes synchronisées qui alimentent les vibrations moléculaires.
La section transversale de diffusion Raman inférieure pose deux principaux défis. D’abord, un signal faible, qui nécessite de longs temps d’acquisition. Deuxièmement, le signal Raman peut être submergé par un fond photoluminescence fort.
La spectroscopie à transformée de Fourier permet l’acquisition parallèle du spectre sur tous les pixels pour une mesure plus rapide, et l’échantillonnage ajustable permet d’accéder à des informations spectrales spécifiques telles que l’isolement des pics Raman faibles à partir d’un fond luminescente fort. L’approche de la transformée de Fourier permet un échantillonnage intelligent et une analyse des données qui exploitent l’information dans des traces temporelles. Nous visons à adapter les stratégies de sous-échantillonnage afin de raccourcir encore le temps d’acquisition.
Pour commencer, utilisez un grattoir pour déposer 20 milligrammes de chaque poudre de pigment sur une balance de précision, obtenant ainsi un rapport de poids un pour un. Mélangez les poudres avec un mortier pour enlever les grumeaux. Verser le mélange obtenu sur une lame de microscope.
Ensuite, utilisez la pointe du grattoir pour appuyer doucement afin d’obtenir une épaisseur presque uniforme de la couche. Appliquez du vernis à ongles sur les bords d’une gaine de housse de microscope. Placez-le sur le mélange avec le vernis à ongles vers le bas, et appliquez assez de pression pour le sceller.
Ensuite, réglez la longueur d’onde d’excitation et concentrez le laser d’excitation à l’entrée de la grande fibre multimode à noyau. Placez un échantillon d’essai sur la scène du microscope et allumez la caméra pour observer le point éclairé au laser. Fixez une section centrale de la fibre à la membrane vibrante d’une bobine mobile, ce qui éliminera les taches.
Brouillez mécaniquement la fibre en la pliant fermement pour fusionner tous ses modes spatiaux. Insérez un filtre passe-bande étroit à 532 nanomètres avec une bande passante de 2,0 nanomètres pour nettoyer la ligne laser et rejeter toute bande spectrale spectrale de pompage indésirable. Utilisez un miroir dichroïque pour réfléchir la lumière laser vers l’échantillon et transmettre le rayonnement rétrodiffusé décalé vers le rouge collecté par l’objectif.
Insérer un filtre passe-long à 532 nanomètres pour rejeter la lumière résiduelle d’illumination. Mesurez la puissance sur le plan d’échantillonnage avec un photomètre. Ajustez le faisceau de la pompe pour obtenir une intensité à l’échantillon qui ne cause pas de dommages.
Maintenant, placez l’échantillon sur la scène du microscope et ajustez la mise au point. Allumez le transducteur du moteur qui effectue la translation en coin et appuyez sur l’option acquisition. Ensuite, réglez les paramètres d’acquisition de la caméra comme le délai et le bining matériel pour optimiser l’intensité du signal.
Maintenant, fixez la longueur des pas, la position d’accueil et le nombre de pas. Ajoutez le nom du répertoire et le nom du fichier. Déplacez le point de croix à la position cible et cliquez sur mesure pour commencer l’acquisition d’une image monochrome pour chaque position de coin.
Une fois la mesure terminée, éteignez le laser avant l’analyse des données. Ensuite, générez l’hypercube spectral à partir du jeu de données acquis en chargeant le fichier de correction de position du moteur spécifique au moteur pas à pas, ainsi que le fichier d’étalonnage de fréquence correspondant à l’interféromètre. Fixer la longueur d’onde des spectres à calculer par Fourier, en transformant les interférogrammes de tous les pixels.
Appliquer la fonction d’apodisation qui offre un bon compromis entre élargissement spectrale et réduction des artefacts, comme la fenêtre de Happ-Genzel. Ensuite, générez l’hypercube spectral et enregistrez-le dans des valeurs complexes. Lancez le logiciel d’analyse et ouvrez l’hypercube spectral en valeurs complexes.
Générez une image RGB en fausse couleur et obtenez le spectre moyen dans certaines zones pour analyser l’hypercube spectral. Pour la mesure Raman sur le même champ de vision, ajoutez un filtre passe-bande dans le chemin de détection. Définissez la période et le bining matériel, puis la durée du set, la position d’origine et le nombre d’étapes.
Choisissez le nom du fichier et le répertoire pour sauvegarder avant d’appuyer sur Mesure. Trois pigments sont clairement distingués dans le champ de vision grâce à leurs signatures spectrales Raman, avec des pics caractéristiques pour le rutile à 454 et 616 centimètres inverses, l’anatase à 396, 514 et 641 centimètres inverses, et le jaune cadmium à 301 et 605 centimètres inverses. Dans la carte de photoluminescence, le jaune de cadmium est le seul pigment visiblement distribué sur le champ de vision, avec une forte émission dominant toute l’image.
En effet, l’émission de défauts faibles du rutile et de l’anatase ne peut être distinguée spectralement de la poudre jaune.
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Aperçu
Cet article traite du développement d'un microscope hyperspectral multimodal qui permet l'acquisition rapide des spectres Raman et de photoluminescence de chaque pixel d'une image. La conception innovante réduit considérablement le temps de mesure par rapport aux méthodes conventionnelles.
Composantes clés de l'étude
Domaine de science
- Neuroscience
- Imagerie optique
- Spectroscopie
Contexte
- Les approches conventionnelles de balayage raster reposent sur des spectromètres dispersifs.
- Les signaux Raman peuvent être faibles et nécessiter de longs temps d'acquisition.
- Des arrière-plans de photoluminescence intenses peuvent submerger les signaux Raman.
- Des techniques avancées peuvent améliorer les signaux Raman en utilisant la résonance ou des impulsions laser synchronisées.
Objectif de l'étude
- Développer un microscope qui permet l'acquisition parallèle de spectres.
- Permettre une cartographie Raman rapide avec une haute résolution spatiale et spectrale.
- Résoudre les défis posés par les signaux Raman faibles et les arrière-plans de photoluminescence.
Méthodes utilisées
- Développement d'un microscope à transformation de Fourier à champ large.
- Utilisation d'un interféromètre biréfringent compact et ultra-stable.
- Approche dans le domaine du temps pour séparer les signaux de photoluminescence et Raman.
- Acquisition rapide des spectres à environ 5 ms/pixel avec une résolution spatiale d'environ 1 µm.
Résultats principaux
- Le microscope permet l'acquisition parallèle de spectres pour tous les pixels.
- Atteindre une résolution spectrale d'environ 23 cm-1.
- Réduit considérablement le temps de mesure par rapport aux méthodes traditionnelles.
- Sépare efficacement la photoluminescence des signaux Raman.
Conclusions
- Le microscope développé est un outil puissant pour la cartographie Raman rapide.
- Il résout les principaux défis liés à l'acquisition de spectres Raman dans des échantillons biologiques.
- Cette technologie a des applications potentielles dans divers domaines de recherche.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Wide-field Fourier-transform Raman microscopy enables rapid, high-resolution chemical mapping of complex samples, addressing throughput and background interference challenges in early discovery. This capability supports robust target validation and mechanistic de-risking by providing quantitative, spatially resolved molecular information. Accelerated spectral acquisition enhances decision-making at key inflection points in biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-throughput chemical composition mapping for functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing weak Raman signals from photoluminescence background.
- Supports predictive confidence in pathway interrogation through quantitative spectral data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated hyperspectral datasets for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs across large sample areas with minimal dwell time.
- Enables assay standardization and scalability by parallelizing spectral acquisition.
Translational & Preclinical Research
- Provides spatially resolved molecular signatures relevant to disease models when applicable.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting robust chemical characterization.
- Reduces risk of late-stage failure by clarifying sample heterogeneity and composition.
Pipeline & Workflow Integration
This multimodal Raman microscope integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid, quantitative chemical mapping at early and intermediate stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through hyperspectral imaging.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible spectral data for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative, pixel-resolved spectra for robust statistical comparison.
- Translational Research: Aligns molecular imaging outputs with preclinical model requirements when relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Accelerates data acquisition and standardizes spectral analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling rapid, high-content analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hyperspectral imaging and Raman spectroscopy.
- Needs access to advanced optical instrumentation and data analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of acquisition and analysis parameters.
- May require adaptation for different sample types or biological matrices.
- Performance may be limited by sample photoluminescence or weak Raman scattering in some contexts.
