Tomographie par microscopie électronique à transmission à balayage en virologie : imagerie 3D d’échantillons congelés à haute pression et substitués par congélation

L’infection virale pourrait provoquer des altération significatives de l’infrastructure cellulaire. Pour visualiser ces changements en trois dimensions, nous utilisons la tomographie STEM pour l’imagerie des cellules infectées par le virus. La tomographie STEM est chronophage et laborieux.

Cela rend la préparation optimale des échantillons essentielle pour les spécimens biologiques, tels que les ensembles infectés par le virus. La tomodensitométrie STEM conventionnelle est limitée à des maladies d’échantillons d’environ 200 nanomètres. Notre protocole permet l’imagerie 3D de sections plus épaisses.

Cela permet une visualisation plus complète des cellules infectées par le virus et des altérations ultra structurelles. De nombreux virus oncolytiques sont déjà à l’origine des essais cliniques, ainsi, chercheurs et développeurs du monde entier travaillant ensemble, et la science repousse les limites du traitement du cancer et des méthodes de pointe, comme la microscopie électronique et la tomographie STEM, apportent de nouvelles connaissances. Nous continuerons à répondre aux questions virologiques en utilisant la tomographie STEM et en la combinant avec de nouveaux protocoles de préparation et d’autres techniques de microscopie.

Pour commencer, remplissez la boîte LN avec de l’azote liquide en préparation de la manipulation et du transfert des disques de saphir congelés du support de congélation haute pression ou HPF vers les capsules de stockage. Gardez un dewar rempli d’azote liquide à proximité pour remplir la boîte LN si nécessaire pendant le processus de congélation. Gardez une pince à épiler isolée prête.

Préparez les contenants d’échantillons qui contiendront les disques de saphir après la pression de la HPF. Assurez-vous qu’ils aient un couvercle et plusieurs trous pour que l’azote liquide puisse s’y verser, ainsi que de petits poids pour éviter qu’ils ne flottent. Placez le récipient à étiquettes dans la boîte LN pour le prérefroidir avant de l’utiliser.

Ensuite, placez les échantillons dans l’incubateur. Inspectez les disques de saphir sous un microscope lumineux inversé pour vous assurer qu’il y a suffisamment de cellules et une bonne qualité cellulaire avant de commencer la congélation à haute pression. Pour effectuer la HPF, prenez un disque de saphir de la cuvette et tamponnez-le rapidement sur du papier filtre pour éliminer l’excès de substrat.

Placez le disque dans le support HPF avec le côté recouvert de carbone orienté vers le haut, afin de garantir que le numéro deux soit lisible. Trempez une entretoise dorée dans l’hexadécane et placez-la doucement sur le disque saphir. Placez un second disque saphir sur le dessus de l’entretoise avec le côté recouvert de carbone orienté vers le bas pour former une configuration sandwich avec les cellules pointées l’une vers l’autre, afin de vous assurer qu’il n’y a pas d’air piégé.

Fermez le support HPF avec précaution et rapidement pour réduire la pression sur l’échantillon. Insérez le porte-filtre HPF dans le congélateur haute pression. Verrouillez-le conformément aux instructions du fabricant et lancez le processus de congélation.

Ensuite, transférez le porte-HPF dans la LN-box. Ensuite, transférez la pointe transportant les disques de saphir dans la boîte LN pré-refroidie. Extraire soigneusement les disques du support.

Placez les fioles cryo fermées remplies de solution de substitution libre dans un dispositif de substitution libre pré-refroidi à moins 90 degrés Celsius. Attendez que la solution atteigne la même température. Pré-refroidissez les pinces à épiler, un scalpel et une pince ou de grandes pinces en les immergeant dans de l’azote liquide pour les utiliser dans le transfert des disques de saphir.

Transférez les échantillons congelés à haute pression dans le dispositif de substitution libre. Séparez les disques de saphir un par un, tout en les conservant dans de l’azote liquide. Et transférez rapidement chaque disque individuellement dans un flacon cryo avec une solution de substitution libre, en veillant à ce que le disque soit complètement immergé.

Après avoir fermé le flacon cryogénique, remettez-le immédiatement dans le dispositif de substitution libre. Une fois tous les échantillons placés, commencez le processus de substitution. Dès que les échantillons atteindront 20 degrés Celsius.

Continuez à laver les échantillons trois fois pendant 30 minutes chacune avec de l’acétone à 100 %. Pour pré-incruster les échantillons, incubez-les dans un tiers de résine époxy et deux tiers d’acétone pendant une heure. Après avoir incubé les échantillons avec deux tiers de résine époxy et un tiers d’acétone pendant une heure, échanger la solution par de la résine époxy à 100 % et incuber toute la nuit avec le couvercle du flacon ouvert pour permettre à l’acétone restante s’évaporer le lendemain, transférer les disques de saphir dans de nouveaux tubes de réaction marqués remplis de résine époxy fraîchement préparée.

Placez les disques horizontalement soutenus par la paroi du tube, en veillant à ce que le côté avec les cellules soit orienté vers le haut. Ensuite, placez les tubes de réaction avec les couvercles ouverts dans un four réglé à 60 degrés Celsius et laissez la résine polymériser pendant au moins 48 heures. Après que la résine époxy s’est polymérisée, immergez la pointe d’un tube de réaction fermée dans de l’azote liquide pendant environ 10 secondes.

Frappez le tube de réaction sur une table pour libérer le bloc de résine. Le disque de saphir se sépare facilement de la couche de carbone, qui reste attachée aux cellules intégrées. Sélectionnez la région d’intérêt dans l’échantillon intégré et réduisez la taille de l’échantillon à la région d’intérêt.

À l’aide d’un ultramicroton avec un couteau diamanté, collectez des sections d’environ un micromètre d’épaisseur sur une grille à barres parallèles chargées en poly-L-lysine traitée à la poly-L-lysine pour l’imagerie STEM et la tomographie STEM. Traitez les sections avec de l’or colloïdal comme marqueurs fiduciaux et appliquez un revêtement au carbone. Après avoir coupé et inspecté les sections ultra-fines, les échantillons sont prêts pour l’imagerie.

D’après la question de recherche, insérez soit le détecteur de champ clair, soit le détecteur de champ noir, ou les deux. Activez le mode de balayage et obtenez une image test de l’échantillon. Sélectionnez un grossissement supérieur à 800 000 fois, ce qui est supérieur au gros final souhaité.

Près de la région d’intérêt, ajustez la mise au point et corrigez l’astigmatisme tout en évitant l’exposition directe au faisceau sur les zones critiques de l’échantillon. Réglez la hauteur excentrique de façon à ce que la région d’intérêt, ou ROI, reste centrée tout au long de la plage d’inclinaison. Choisissez une caractéristique proche du ROI, amenez-la au centre, faites la mise au point, corrigez l’astigmatisme et inclinez la scène par étals à moins 72 degrés.

Pour choisir le champ de vision, revenez au ROI, mettez-le au point et capturez une image d’ensemble. Régler le grossissement final souhaité pour l’acquisition en série d’inclinaison. Configurez l’acquisition automatique en série par inclinaison des images, allant de moins 72 degrés à plus 72 degrés et une image tous les 1,5 degré.

Commencez l’acquisition automatique de la série d’inclinaison. Des tranches virtuelles représentatives du thermogramme STEM ont illustré comment l’orientation des virions influence la visibilité de la forme caractéristique de la balle dans des vues bidimensionnelles. Seuls les virions alignés parallèlement au plan de vision apparaissaient avec la morphologie complète bien définie de la balle, tandis que d’autres paraissaient circulaires ou allongés, selon leur angle d’inclinaison.

Pour surmonter les limites d’orientation de l’imagerie 2D, la tomographie STEM a été utilisée pour capturer de grands groupes de virion du virus de la stomatite vésiculaire recombinante en bourgeonnage, permettant d’évaluer la forme du virion en trois dimensions sans biais directionnel. La vue latérale du thermogramme a confirmé l’avantage volumétrique de la tomographie STEM qui capture de nombreux virions complets dans une seule section de 600 nanomètres d’épaisseur, contrairement à l’échantillonnage limité possible avec une section TEM de 200 nanomètres.