Cartographie moléculaire à double modalité : intégration de la détection multiplex de l’ARNm avec la cytométrie de masse par imagerie protéique

Nous nous concentrons sur une biologie spécialisée afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires du cancer de l’ovaire dans l’espoir de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques et biomarqueurs pour prédire la survie des patients. L’un des défis actuels de la CMI inclut la dissection des protéines à faible abondance, la validation et la titrage des anticorps, ainsi que la classification complexe et chronophage des pixels lors de l’analyse. Commencez par retirer l’excès de liquide des lames FFPE préparées.

Sortez la plaque de contrôle d’humidité du four et placez le porte-cullette dans la plaque. Ensuite, utilisez soigneusement l’amplificateur ARN-ISH 3 du vortex, et ajoutez suffisamment de réactif pour recouvrir complètement chaque section de tissu sur les lames. Fermez la plaque et insérez-la dans le four d’hybridation pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius.

Lors de l’incubation, préparez le mélange métallique d’oligonucléotides en diluant chaque oligo à un ratio de un/15. Mélangez soigneusement l’oligo métallique en vortex, et laissez-le à température ambiante jusqu’à une utilisation supplémentaire. Maintenant, retirez la plaque de contrôle d’humidité du four.

Retirez le porte-lames de la plaque et remettez la plaque dans le four. Ensuite, placez les lames dans un porte-lames transparent préalablement lavé avec de l’eau sans nucléase. Lavez les lames dans un tampon de lavage sous légère agitation pendant deux minutes.

Après avoir retiré l’excès de liquide des lames, sortez la plaque de contrôle d’humidité du four et placez le porte-lames dans la plaque. Ajoutez les oligonucléotides mélangés préparés plus tôt pour recouvrir complètement chaque section de tissu. Maintenant, fermez complètement la plaque et insérez-la dans le four d’hybridation pendant 45 minutes à 40 degrés Celsius.

Retirez la plaque de contrôle d’humidité du four d’hybridation, retirez le porte-coulière, puis remettez la plaque vide dans le four. Pour bloquer les sites de liaison non spécifiques, ajoutez un volume suffisant de tampon de blocage pour couvrir entièrement chaque section de tissu sur la lame, puis faites couver les lames à température ambiante pendant 30 minutes. Pendant que les lames sont en incubation, préparez le mélange d’anticorps en diluant les anticorps à l’aide du tampon diluant anticorps.

Une fois l’incubation terminée, il faut éliminer le tampon des lames tissulaires et dispenser suffisamment de mélange d’anticorps préparé pour couvrir complètement les sections tissulaires. Ensuite, placez les lames dans une chambre d’humidité et faites couver-les toute la nuit à quatre degrés Celsius. Pour préparer une solution fraîche d’intercalateur Iridium, effectuer une dilution de un à 2 000 à partir d’une solution de stock de 500 micromolaires en utilisant un TBS sans RNase.

Placez les lames dans un porte-lames transparent préalablement lavé avec de l’eau sans nucléase, puis lavez les lames dans un tampon TBS-T en agitant légèrement pendant cinq minutes. Ensuite, pour colorer les lames, ajoutez la solution de travail en Iridium préparée, puis faites incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, placez les lames dans un porte-lames transparent préalablement lavé avec de l’eau sans nucléase.

Lavez les lames deux fois dans le tampon TBS-T avec une légère agitation pendant cinq minutes. Ensuite, trempez rapidement les lames dans de l’eau double distillée pour éviter la cristallisation du sel causé par le TBS sur le tissu. Faites sécher les lames sous une hotte chimique pendant 10 minutes, puis conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à l’acquisition de l’image.

Chargez la lame préparée dans la chambre d’ablation du système de cytométrie de masse d’imagerie. Capturez une image panoramique de la diapositive pour identifier la région d’intérêt. À l’aide du logiciel d’acquisition d’images, marquez les régions d’intérêt souhaitées sur l’image panoramique.

Applique le modèle d’acquisition dans le logiciel d’acquisition d’images. Et ajustez la puissance du laser en fonction du type d’échantillon. Maintenant, commencez le processus d’ablation au laser.

Mesurez la quantité de chaque isotope à l’aide du détecteur, qui convertit les données en format numérique pour analyse. Le statut d’activation des lymphocytes T CD8 a été évalué grâce à la co-détection de granzyme B à la fois au niveau de l’ARNm et des protéines, ainsi que de positivité interféron-gamma. Un fibroblaste associé au cancer a montré exprimer la protéine MFAP5 et l’ARNm POSTN, deux marqueurs de l’agressivité des fibroblastes associée au cancer.

Un lymphocyte T CD4 a été démontré co-exprimant l’ARNm d’IL17A et d’IL6, ce qui correspond à l’identité de la cellule TH17. Des cellules T CD4 ont été observées exprimant de l’ARNm IL13. Des cellules tumorales CD47 positives à la kératine ont été observées près d’une cellule T CD8.

Un lymphocyte T CD8 activé a montré qu’il exprimait la protéine CD25. Une coloration comparable à l’ARNm de THBS2 et CD47 a été observée entre protocoles conjugués au métal et marqués au fluor.