Profilage spatial complet de transcriptomes agnostiques par stéréo-seq

Nos recherches portent sur la caractérisation détaillée du microenvironnement tumoral ovarien afin d’identifier les biomarqueurs prédictifs et thérapeutiques. Par exemple, nous aimerions trouver des marqueurs pour prédire la réponse et la résistance à la chimiothérapie ou de nouvelles cibles thérapeutiques pour les traitements de seconde ligne. Les défis expérimentaux incluent la manipulation de l’échantillon, l’évaluation de la qualité de l’échantillon et la durée de traitement de l’échantillon.

Du côté de l’analyse des données, les défis incluent des éléments comme la rareté des données, similaire à d’autres processus à cellule unique, ou aussi la cartographie des zones, en particulier des régions répétitives. Après avoir retiré la puce N-Chip stéréo de son emballage, notez le numéro d’identification de la puce. Sans toucher la surface N-Chip, nettoyez la lame en verre avec 100 % d’éthanol.

À l’aide d’une micro-pipette, appliquez soigneusement 10 microlitres de résine céramique à curation ultraviolette autour du bord de la puce N-Chip stéréoséquencante. Utilisez un écouvillon en mousse scellée pour éliminer l’excès de résine, ne laissant qu’une fine ligne autour du bord de l’éclat. Placez la culasse dans le dispositif de durcissement ultraviolet, en veillant à ce que la surface de la puce ne soit pas touchée.

Placez maintenant la puce appliquée en résine sur un masque opaque sur la source de lumière ultraviolette de 405 nanomètres pour illuminer le dos de la lame, et durcez pendant cinq minutes. Après le durcissement du durcissement (polymérisation), utilisez des écouvillons en mousse scellés trempés dans de l’éthanol 100 % de qualité moléculaire, puis de l’éthanol à 70 %, et enfin de l’eau sans nucléase pour nettoyer autour du bord appliqué à la résine. Immergez la puce trois fois dans de l’eau fraîche sans nucléase à l’aide d’un tube conique de 50 millilitres.

À l’aide d’air comprimé, séchez la cope avec toute la force de l’air à un angle d’environ 60 à 80 degrés, en se déplaçant en diagonale sur la surface à environ cinq centimètres de distance. Ensuite, appliquez 150 microlitres de solution de poly-L-lysine uniformément sur toute la surface de la puce, puis faites couver la puce pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, retirez la solution de poly-L-lysine de la puce.

Après le second lavage, séchez soigneusement les bords de la culasse sans toucher la surface des éclats. Séchez fermement la puce à l’aide d’air comprimé, comme démontré précédemment. Lors de la coupe du tissu FFPE, ne touchez pas directement la puce et ne couvrez que 80 % de la puce avec du papier mouchoir.

Pour préparer deux microlitres de solution de coloration à ADN simple brin dans un tampon SSC, diluez le réactif d’ADN simple brin Qubit avec un tampon SSC 5X. Créer un mélange maître de la solution de coloration en utilisant une dilution de 1 à 20 d’inhibiteur de ribonucléase, une dilution de un à 200 de la solution d’ADN simple brin, et le volume restant avec un tampon SSC 5X. Ajoutez 150 microlitres de solution colorante à chaque copeau et faites éclore dans le noir à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, retirez doucement la solution de tache du coin de chaque éclat à l’aide d’une pipette. Après avoir lavé la puce deux fois avec un tampon SSC 0,1X pendant 10 à 15 secondes, séchez soigneusement les bords de la glissière. Ajoutez environ trois à cinq microlitres de glycérol sur la lame pour la monter.

Laissez tomber une gaine d’environ un centimètre au-dessus de la glissière, en la maintenant à plat et en veillant à ce qu’elle ne touche pas la surface de l’éclat. Capturez des images fluorescentes de tissu coloré à l’ADN simple brin à l’aide d’un microscope à large champ, en assurant un chevauchement de 10 % entre les tuiles d’image. Assemblez les images acquises dans un logiciel de traitement d’image comme ImageJ en utilisant d’abord le chevauchement théorique pour générer des positions approximatives des tuiles, puis en appliquant un chevauchement computationnel de correspondance de pixels pour affiner le pavage.

Traitez les images assemblées dans le logiciel StereoMap, et assurez-vous que le contrôle qualité d’image est passé avant de continuer. Immergez la glissière de séquençage stéréo dans 30 millilitres de tampon SSC 0,1X jusqu’à ce que la coulisse se détache. Assurez-vous que le réactif de désentreticulation en FFPE est à température ambiante et inspectez-le pour détecter des particules.

Allumez le thermocycleur et réglez-le à 30 degrés Celsius pour l’équilibre, 95 degrés Celsius pour une incubation de 30 minutes, et maintenez à l’infini à quatre degrés Celsius. Montez le joint de la cassette et placez la glissière de la puce de séquençage stéréo dans la cassette. Ensuite, ajoutez un réactif de désindexation en FFPE dans le puits de la cassette culasse stéréoséquente, appliquez du ruban adhésif sur la cassette et confirmez qu’elle est bien étanche.

Commencez l’incubation de 30 minutes à 95 degrés Celsius. Après 10 minutes, placez 25 millilitres de méthanol dans un récipient de 50 millilitres dans un congélateur à 20 degrés Celsius, en préparant environ un millilitre par lame pour une utilisation ultérieure. Après avoir retiré la puce du thermocycleur, transférez la cassette cullissante sur le banc et décollez le ruban adhésif.

À l’aide d’une pipette, retirez et jetez le réactif de désentreticulation en FFPE de la cassette. Une fois le réactif complètement retiré, détachez la cassette et le joint et jetez-les. Sous une hotte stérile, séchez le bord de la culasse et installez une nouvelle chambre en silicone si nécessaire.

Ajoutez 500 microlitres de méthanol refroidi provenant du congélateur à 20 degrés Celsius, en assurant que toute la section soit immergée. Préchauffez la solution PR sur un bloc sec à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes avant utilisation. Après fixation, dans une hotte à fumée, essuyez tout excès de méthanol de la lame et attendez que le méthanol restant sur la puce s’évapore.

Assemblez un nouveau joint d’extrémité de cassette. Une fois l’évaporation terminée, placez la glissière de puce stéréo dans la cassette. Ajoutez 200 microlitres de réactif de perméablisation préchauffé à la puce.

Appliquez du ruban adhésif sur la cassette culasse stéréoséquente et assurez-vous qu’elle est bien étanche. Effectuez la transcription inverse puis la libération et la purification du CDNA en suivant les étapes illustrées ici. Préchauffez l’eau sans nucléase à 37 degrés Celsius.

Retirez le joint de la puce. Pipette vigoureusement dans chaque coin et au centre de l’ébréchage sur le mouchoir sans le gratter ni le toucher. Collectez tout le mélange de libération d’ADN complémentaire de la puce et transférez-le dans un tube centrifugeuse de 1,5 ou 2,0 millilitres.

Ajoutez 350 microlitres d’eau préchauffée sans nucléase directement sur la surface de la puce. Pipette vigoureusement avec une petite pipette, en inclinant la pointe pour appliquer une force de cisaillement sans toucher le mouchoir ni gratter l’éclat. Combinez le lavage avec les 400 microlitres de mélange d’ADN complémentaire collectés plus tôt, afin de garantir que seul le matériau d’une seule puce soit combiné.

Placez 100 microlitres d’eau sans nucléase sur la puce. Scellez la lame de séquençage stéréo et conservez-la au réfrigérateur jusqu’à la fin du protocole. La segmentation monocellulaire via le pipeline SAW a été réalisée sur des sections FFPE, permettant la cartographie vers des ARN non polyadénylés tels que l’ARNt et TRDMT1.

La visualisation spatiale interactive a montré des types cellulaires présumés à l’aide du logiciel propriétaire StereoMap, avec des clusters affichés dans différentes couleurs sur une région du tissu zoomée. L’expression dans tout le tissu de l’ARN non polyadénylé TRDMT1 a été visualisée à l’aide de StereoPi. Les adaptations du protocole abordent les problèmes que nous avons rencontrés dans le profilage spatial transcriptomique complet des tissus adipeux et fragiles en améliorant l’adhésion tissulaire, l’accessibilité de l’ARN et la gestion des stéréo-séquences sur ces types de tissus difficiles.

Le stéréo-seq offre actuellement une résolution supérieure à celle des autres méthodes transcriptomiques spatiales, avec une résolution de 500 nanomètres contre deux microns. Il fournit également une capture impartiale nécessaire à l’étude du microbiome, des transcrits viraux et non polyadénylés.