Détermination structurelle de l’hémagglutinine à partir de la cryotomographie électronique des virus de la grippe

Notre laboratoire utilise la biologie structurale pour étudier les virus et l’évolution de la résistance aux médicaments. Dans les travaux actuels, nous caractérisons comment l’hémagglutinine de la grippe modifie la conformation lors de la liaison des récepteurs. Nous avons utilisé la tomographie cryo-électronique pour visualiser l’organisation et la structure de la morphologie virale.

Plus précisément, nous avons utilisé cette modalité de cryomicroscopie électronique pour imager la grippe virale pléomorphe. Notre protocole nous permet d’étudier l’organisation et la structure de l’hémagglutinine de la grippe in situ sur des virus intacts à une résolution sub-nanométrique. Cette résolution plus élevée nous permet de visualiser des interactions auparavant cachées.

Pour commencer, lancez un terminal Linux pour activer l’environnement Conda. Utilisez le terminal pour activer l’environnement Conda avec le net ISO installé. Créez un sous-dossier nommé tomo folder, puis déplacez tous les fichiers tomogram dans ce dossier.

Ensuite, utilisez le code pour générer un fichier étoile dans le dossier du projet. À l’aide d’un éditeur de texte, ouvrez le fichier étoile généré et entrez la valeur approximative de défocalisation des images à inclinaison à zéro degré dans la quatrième colonne. Exécute maintenant la commande de convolution CTFD dans le terminal.

Après déconvolution, activez l’environnement GUI EMAN2 pour commencer le prétraitement du picking des particules. Sous tomographie, cliquez à gauche sur la flèche à côté de données brutes, sélectionnez importer des tomographies dans le menu déroulant, puis choisissez les fichiers. Ensuite, cliquez gauche sur la flèche à côté de segmentation et choisissez tomographies pré-traitées.

Utilisez des paramètres par défaut appropriés. Après le prétraitement, un répertoire d’information contenant des fichiers JSON vierges correspondant aux noms de base des fichiers tomographie du procédé sera créé automatiquement. Ajoutez des informations sur les pixels angstrom aux fichiers avant de continuer.

Pour entraîner un réseau neuronal convolutionnel, ou CNN, à reconnaître la glycoprotéine HA, changez le répertoire de travail vers l’emplacement des tomogrammes à utiliser. Ensuite, ouvrez l’interface d’entraînement CNN via le terminal. Confirmez que quatre fenêtres sont ouvertes.

L’une contenant les informations sur les paramètres CNN et les tomogrammes dans le répertoire, et les trois autres fenêtres contenant des images de bonnes références, de mauvaises références et de particules sélectionnées par le CNN. Dans l’interface graphique CNN, cliquez sur la nouvelle option pour initialiser un CNN avec un taux d’apprentissage par défaut de 0,0001 et une taille de boîte de huit. Dans la colonne nom de fichier, cliquez à gauche sur un tomogramme représentatif pour l’ouvrir.

Passez la souris sur le tomogramme ouvert et cliquez sur la molette de la souris pour ouvrir une nouvelle fenêtre. Cliquez à gauche sur le curseur du nombre N pour parcourir l’axe Z. Ensuite, sur le tomographie ouvert, utilisez le panneau de bonnes références pour sélectionner 10 à 20 caractéristiques correspondant à l’HA. Des images positives apparaissent dans la fenêtre positive.

Pour en retirer un, maintenez la fonction shift et cliquez dessus gauche. Passez maintenant au panneau de références défectueuses et sélectionnez 10 à 20 références correspondant à des caractéristiques telles que des patchs de membrane vides, la densité RNP, les marqueurs fiduciaux et les débris. Réglez le nombre d’itérations à 50 et cliquez sur l’icône du train pour commencer la formation CNN.

Après la formation, appuyez sur appliquer. Les particules sélectionnées seront affichées sur le tomogramme sous forme de cercles bleus ou peuvent être vues dans la fenêtre des particules. Continuez à affiner en sélectionnant des références positives et négatives supplémentaires, en cliquant périodiquement sur enregistrer pour préserver la progression.

Une fois que le CNN fonctionne correctement, cliquez sur appliquer tout pour lancer le picking de particules. Ensuite, évaluer les résultats de plusieurs tomographies et réentraîner selon les besoins. Pour enregistrer les coordonnées de chaque tomogramme, rouvrez l’interface graphique EMAN2 en utilisant la e2projectmanager.py de commandes.

Cliquez sur la flèche sous la moyenne des sous-tomogrammes et sélectionnez boxe manuelle. Maintenant, entrez le nom du tomogramme et cliquez sur lancer. Ensuite, cliquez séquentiellement sur fichier, sauvegardez le fil de la boîte, et tomogram_ha.

Envoyez un message pour enregistrer les coordonnées. Navigue vers les sous-dossiers du réseau neuronal et des sous-dossiers infos pour sauvegarder et sauvegarder sur le réseau. HDF, sorties de formation.

HDF, des segouts. hdf, et boxes3Dref.hdf. Entraînez un second CNN pour détecter la couche de protéine M1 et la présence de VRNP en changeant la taille de la boîte d’entraînement de huit à quatorze.

Pour sélectionner les particules, téléchargez d’abord les notebooks depuis le dépôt GitHub. Ensuite, ouvrez le CNN de nettoyage des particules du notebook IPYNB, et chargez les modules requis. Chargez les fichiers texte des coordonnées HA et M1 dans le carnet.

Voyez-les comme des nuages 3D en utilisant la bibliothèque 3D ouverte. Ensuite, filtrez les valeurs aberrantes des coordonnées HA en utilisant une méthode d’élimination des valeurs aberrantes statistiques 3D ouvertes. Ensuite, calculez les distances entre les nuages de points HA et M1 en identifiant les points HA situés à plus de 20 pixels de M1 comme valeurs aberrantes et enregistrez les coordonnées restantes dans un fichier texte de sortie.

Concaténez toutes les particules et enregistrez en fichiers star en utilisant le fichier star pts2. IPYNB. En utilisant WarpTools, extraire les particules qui courbent le facteur quatre et effectuer la moyenne initiale de sous-tomogrammes en RELION moins quatre en utilisant le code. Convertissez le fichier Warp Star au format RELION quatre.

Ensuite, générez une référence initiale en utilisant RELION refine MPI sur un sous-ensemble de particules. Effectuez un raffinage automatique 3D sur les sous-tomogrammes avec RELION refine MPI. Lors de la convergence, répétez l’auto-raffinement avec le décalage de translation titan à huit et le pas à deux.

Utilisez la classification 2D pour éliminer les particules inutiles grâce au raffinage RELION. Créez des fichiers étoiles avec de bonnes classes en utilisant le code, puis combinez les fichiers étoile individuels. Les tomographies représentatives ont révélé des virions pléomorphes aux formes allant de sphériques à allongées.

La moyenne finale du subtomogramme a atteint une résolution globale de 6,0 angströms avec une résolution locale allant de cinq à sept angströms. Les hélices alpha et les feuilles bêta ont été résolues lors de la reconstruction finale de l’AH, soutenant la qualité structurelle de la carte affinée. Les sites de glycosylation étaient identifiables à quatre positions sur la tête et la tige de l’HA, confirmant la visibilité de la densité glycanée lors de la reconstruction finale.