Méthode peu invasive de génération d’un modèle murin orthotopique syngénique de cancer du poumon

Nos recherches actuelles portent sur la compréhension des maladies du cancer du poumon et sur la manière de développer de nouvelles modalités de traitement compatibles avec la thérapie standard, notamment la chimiothérapie, la radiothérapie et l’immunothérapie. Nous n’avons pas trouvé de modèle orthotopique du cancer du poumon établissant des critères spécifiquement pour étudier le cancer du poumon à un stade précoce. Nous travaillons à fournir des directives claires et reproductibles pour combler cette lacune avec ce protocole.

Ce protocole est peu invasif et simple à appliquer. De plus, avec les critères que nous avons fournis, ce protocole permet le dépistage précis de l’implantation tumorale et permet une détection précoce des tumeurs par imagerie bioluminescente. Ce protocole permet aux chercheurs d’étudier le cancer du poumon à un stade précoce dans le tissu hôte, permettant ainsi l’avancement préclinique de nouvelles thérapies contre le cancer et l’investigation du microenvironnement tumoral.

Nous utiliserons cette technique pour évaluer précliniquement les mécanismes et l’efficacité de nouveaux traitements passionnants contre le cancer du poumon et espérons qu’elle pourra conduire à des soins futurs aux patients. Pour commencer, placez la souris anesthésiée dans un cône nasal en position allongée sur un appareil de chauffage, et appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux de la souris. Une fois l’anesthésie confirmée, utilisez une tondeuse électrique pour retirer la fourrure d’une zone rectangulaire de deux par trois centimètres sur le côté dorsal gauche de la souris.

Rasez la colonne vertébrale médialement, la table latéralement, la dernière côte vers le bas et le bord supérieur de l’omoplate vers la tête jusqu’à ce qu’aucune fourrure ne soit visible. Placez la souris dans une cage vide sur un appareil de chauffage. Observez le rythme respiratoire jusqu’à ce que la souris retrouve sa vigilance, puis ramenez-la dans sa cage jusqu’à l’opération.

Le jour de la prélèvement, ajoutez un milieu frais contenant 50 milligrammes par millilitre de gentamycine à la plaque de culture trois à quatre heures avant la collecte. Aspirez le milieu de la plaque de culture et lavez les cellules attachées avec 1x PBS. Ensuite, incubez les cellules avec une solution de trypsine EDTA pendant une à deux minutes à 37 degrés Celsius.

Ajoutez un nouveau substrat pour neutraliser la trypsina. Dispersez les cellules en tapotant doucement ou en pipettant la plaque. Ensuite, collectez la suspension de cellules dans un tube conique de 50 millilitres.

Maintenant, centrifugez le tube conique à 1 200 G pendant trois minutes à température ambiante. Après avoir confirmé la présence d’un comprimé compact au fond, aspirez le surnageant et lavez le granule avec du PBS. Resuspendez la granule de cellules lavées dans le PBS pour atteindre une concentration d’environ un à deux millions de cellules par millilitre pour le comptage.

Filtrez la suspension à travers une tamoire à cellules de 40 micromètres avant de continuer. Ensuite, combinez 10 microlitres de suspension cellulaire avec 10 microlitres de bleu de trypan. Chargez l’échantillon coloré dans un hémocytomètre et comptez les cellules.

Calculez le nombre total de cellules et la viabilité des cellules. Centrifugez à nouveau les cellules à 1 200 G pendant trois minutes à température ambiante et aspirez le PBS en quittant la pellete. Resuspendez la granule cellulaire dans 0,5 milligramme par millilitre de gel de métra dans PBS.

Ajustez au nombre de cellules désiré dans un volume total d’injection de 50 microlitres. Gardez la suspension de la cellule sur glace pour éviter la solidification de la matrigel. Nettoyez le site chirurgical de l’animal anesthésié trois fois à l’aide de gaze stérile, en alternant entre Bétadine et éthanol à 70 %.

Placez un drap chirurgical fenestré stérilisé avec une ouverture de trois par quatre centimètres au-dessus de la souris et posez des instruments chirurgicaux autoclave au-dessus du drap. À l’aide d’une pince, identifiez le bord crânien de l’omoplate et le bord de cajolage de la cage thoracique thoracique. Avec la peau tendue entre le pouce et l’index du chirurgien, réalisez une incision superficielle de cinq millimètres directement sous l’omoplate à l’aide d’une lame de scalpel de taille 10.

Ensuite, utilisez des ciseaux droits de 115 millimètres pour émousser la graisse sous-cutanée des côtes et des muscles intercostaux sans les couper. Pour arrêter tout léger saignement causé par des dommages capillaires, pressez légèrement un applicateur stérilisé à extrémité de coton sur la zone de saignement. Maintenez l’incision ouverte à l’aide de micro ads et de pinces.

En commençant par la septième vraie côte, utilisez des pinces médian courbées pour compter vers le haut et localiser les quatrième et cinquième côtes. Marquez cette région comme site d’injection. Maintenant, inversez doucement le tube de suspension de la cellule trois à quatre fois pour mélanger.

Juste avant l’injection, puisez 50 microlitres de la suspension dans une seringue stérile de 300 microlitres de 31 gauges à huit millimètres, en veillant à ne pas avoir de bulles. Placez une bande de ruban métallique stérilisé de quatre millimètres d’épaisseur raté à la seringue pour servir de bouchon et contrôler la profondeur d’injection. Injectez la suspension de cellules de 50 microlitres à un angle de 90 degrés dans l’espace intercostal entre les côtes quatre et cinq juste sous la quatrième nervure, et maintenez l’aiguille en position pendant deux à trois secondes.

Retirez lentement l’aiguille sous le même angle que celle insérée et jetez-la dans un récipient à objets tranchants. Enfin, fermez l’incision cutanée à l’aide de deux à trois points carrés noués et appliquez un adhésif chirurgical vétérinaire sur les points pour renforcer la fermeture de la plaie. L’imagerie par bioluminescence a détecté des signaux associés aux tumeurs chez les souris expérimentales dès un jour après l’injection, et la radiance a augmenté visiblement dans le temps pour 25 000 et 50 000 cellules par groupe de souris, avec une intensité plus élevée observée dans le groupe de 50 000 cellules.

Le flux tumoral total a augmenté de façon exponentielle dans les groupes cellulaires de 25 000 et 50 000, atteignant plus de 10 fois 10 à la puissance de huit photons par seconde au jour 21 dans le groupe de 50 000 cellules. Les souris de Sham ne présentaient ni luminescence ni tumeur visible dans les poumons disséqués, tandis que les souris expérimentales présentaient une luminescence élevée et des masses tumorales rouges dans les tissus pulmonaires. À 21 jours après l’injection, les souris incluses présentaient des tumeurs confinées au lobe pulmonaire gauche sans invasion des régions environnantes.