Utilisation de la microperfusion cérébrale à flux ouvert pour la collecte longitudinale de liquide interstitiel dans un modèle animal de glioblastome

Nous caractérisons les composants de signalisation soluble dans le liquide interstitiel de la tumeur cérébrale qui contribuent à la progression de la maladie et à la réponse au traitement. L’évaluation des concentrations absolues de soluté dans l’interstitiel tumoral cérébrale reste un défi d’investigation nécessitant l’utilisation de méthodes expérimentales sophistiquées. Pour commencer, avec un scalpel stérile, réalisez une incision sagittale de la ligne médiane le long de la surface du crâne, en commençant entre les yeux et en s’étendant caudal sur 8 à 10 millimètres.

Ensuite, utilisez des pinces stériles pour rétracter latéralement la peau de l’incision médiane. Assurez-vous que la bregma et la lambda sont visibles, et prolongez l’incision si nécessaire. Ensuite, avec un scalpel stérile, incisez le périoste et rétractez le tissu latéralement avec une pince.

Appliquez du peroxyde d’hydrogène à 1 % à 3 % avec un applicateur stérile à extrémité de coton pour nettoyer la surface du crâne. Utilisez maintenant une seringue d’insuline de 0,3 à 1,0 millilitre pour appliquer 20 à 40 microlitres d’adhésif dentaire auto-gravant de façon uniforme sur la surface du crâne. Ensuite, exposez-le à une lampe de durcissement dentaire pour graver l’adhésif.

Une fois durcie, essuyez tout excès d’adhésif avec des applicateurs stériles à extrémité de coton et du sérum physiologique. Repositionnez la mèche à la coordonnée guide cOFM. Réglez la perceuse à 15 000 tours par minute et percez un trou de meule avec le cadran micro-manipulateur DV.

Surveillez fréquemment l’épaisseur du crâne lors du forage, puis rincez avec du sérum physiologique pour éliminer les débris et réduire la chaleur. Répétez la procédure de forage à chaque coordonnée d’ancrage de vis. Installez maintenant des vis d’ancrage à l’aide de pinces stériles et d’un tournevis stérile jusqu’à insertion d’une à deux longueurs de filetage.

Ensuite, montez le guide cOFM et l’assemblage factice dans le porte-guide et fixez le support au cadre stéréotaxique. Placez la pointe guide au-dessus du trou de meule et baissez-la lentement jusqu’à la profondeur prédéterminée à 1 millimètre par minute. Appliquez l’agent cimentant sur le crâne en couches fines et uniformes, en recouvrant les zones sous et autour du guide et des vis du cOFM.

Utilisez une lampe de durcissement dentaire pour durcir chaque couche avant d’appliquer la suivante. Assurez-vous que le ciment couvre toute la zone entre les composants tout en évitant le coin de blocage. Détachez le porte-guide du guide cOFM et relevez-le lentement à l’aide du bouton DV du micromanipulateur.

À l’aide de pinces, retirez la coin de verrouillage du guide et de l’assemblage factice cOFM. Soulevez doucement le mannequin du guide. Utilisez les boutons micro-manipulateurs ML et AP pour aligner l’ensemble de l’insert d’infusion de la seringue sur le guide cOFM.

Baissez l’insert d’infusion à l’aide du bouton DV et maintenez-le en place en réinsérant fermement la coche de verrouillage avec une pince. Injectez maintenant 3 microlitres de suspension cellulaire à partir de la seringue à 1 microlitre par minute. Surveillez la zone autour du guide cOFM pour vous assurer qu’aucun efflux de suspension de cellules n’est sorti de l’ensemble.

Utilisez des pinces pour retirer la cale de verrouillage de l’ensemble guide et insert d’infusion. Ensuite, soulevez délicatement l’insert d’infusion du guide à l’aide du bouton de réglage DV. Pré-remplissez les conduites de tube pousse-pull avec du liquide cérébro-rachidien artificiel à l’aide de seringues en verre étanches aux gaz.

Installez la section péristaltique du tube dans la tête de pompe de la pompe à microperfusion. Connectez le sac de perfusion au tube de poussée à l’aide d’un connecteur Luer lock. Ensuite, connectez l’insert d’échantillonnage au tube à l’aide de connecteurs à bride.

Fixez l’arbre d’entrée le plus long à l’extrémité de sortie du tuyau de poussée et l’arbre de sortie plus court à l’extrémité d’entrée du tuyau de tirage. Placez l’insert d’échantillonnage connecté dans un tube microcentrifuge stérile contenant 750 microlitres de liquide céphalorachidien artificiel. Connectez l’aiguille du collecteur de fractions à la conduite de sortie du tube de traction à l’aide d’un connecteur à tubes à bride.

Ensuite, effectuez un rinçage de tubes pendant 20 minutes à 10 microlitres par minute pour éliminer les bulles d’air. Ensuite, pré-remplissez la ligne de tirage avec du liquide céphalorachidien artificiel à l’aide de seringues étanches au gaz. Réinstallez le tube péristaltique dans la tête de pompe de la pompe à microperfusion.

Reconnectez à nouveau l’insert d’échantillonnage à l’aide de connecteurs à tubes à bride. Fixez l’entrée à l’extrémité de sortie du tube de traction et la sortie à l’extrémité d’entrée du tube de tirage. Placez l’insert dans un tube stérile de microcentrifuge contenant 750 microlitres de liquide céphalorachidien artificiel.

Effectuez un autre rinçage du système de tuyauterie de 20 minutes à 10 microlitres par minute pour éliminer les bulles d’air résiduelles. Placez un animal anesthésié dans une veste de taille appropriée. Faites passer les membres antérieurs complètement par les emmanchures et attachez la veste solidement le long du dos de l’animal.

Utilisez une pince pour retirer la cale de verrouillage de l’ensemble guide et factice. Ensuite, soulevez délicatement l’insert factice hors du guide. Installez délicatement l’insert d’échantillonnage dans le guide et réinsérez la cale de verrouillage.

Retirez l’animal de l’anesthésie et placez-le dans le système de cage rotative. Attachez l’attache de la cage à la veste animale et activez le système de cage rotatif. Après l’échantillonnage cOFM, désactivez le système de cage rotative et détachez l’attache de la cage de la veste animale.

Utilisez maintenant des pinces pour retirer la coche de verrouillage de l’ensemble guide et insert d’échantillonnage. Soulevez délicatement l’insert d’échantillonnage hors du guide, puis réinsérez délicatement l’insert factice dans le guide et réinsérez le coin de verrouillage. Détachez les attaches à l’arrière de la veste animale et retirez doucement la veste de l’animal.

L’imagerie bioluminescente a confirmé la présence de tumeurs chez des animaux présentant un engressement cellulaire tumoral médié par guide cOFM. L’analyse protéomique en composantes principales du liquide interstitiel échantillonné par cOFM a révélé une séparation nette entre les groupes animaux traités au témozolomide et traités au diméthyle sulfoxyde. Les distributions globales des signaux métabolomiques se chevauchaient presque parfaitement entre les échantillons de témozolomide et de sulfoxyde de diméthyle.

Malgré le chevauchement des signaux, l’analyse volcanique métabolomique a révélé un décalage distinct causé par le témozolomide. Des comparaisons quantitatives des valeurs métabolomiques des mêmes animaux ont montré que les configurations recirculées amélioraient les concentrations d’analytes tout en préservant les proportions relatives de métabolites. La disponibilité relative des nutriments dans le microenvironnement tumoral cérébral reste peu comprise.

Ce protocole est utilisé pour combler cette lacune. Caractériser la disponibilité et la signalisation des nutriments dans le microenvironnement tumoral peut élucider les mécanismes de progression du gliome et de résistance adaptative au traitement.